壳聚糖纳米粒制备及表征与其抗肿瘤的生物学效应

目的:近期研究发现,壳聚糖纳米化后,不仅可改善其溶解性,还可提高其生物学功能。拟建立壳聚糖纳米粒的制备方法,并对壳聚糖纳米粒的表征及抗肿瘤生物学效应进行初步研究。方法:实验于2006-08/2007-05在浙江省医学科学院生物工程所完成。①建立壳聚糖纳米粒的制备方法:将壳聚糖粉末溶于乙酸溶液,用NaOH调节其pH为5,采用三聚磷酸钠为凝聚剂,进行离子交联来制备壳聚糖纳米颗粒。通过离心和冷冻干燥得到壳聚糖纳米粒粉末。②纳米粒的表征:经超声得到壳聚糖的悬浊液,用透射电镜来观察纳米颗粒的外观形态;用动态光散射仪来测定纳米颗粒的粒径大小与分布。③采用MTT法对壳聚糖纳米粒体外抗肿瘤生物学效应进行了初步研究。结果:①透射电镜下观测到了稳定、均一的颗粒;激光粒度分析仪测量发现纳米粒粒径大小在300nm左右,粒径分布较窄。②500mg/L的壳聚糖纳米粒对Hela细胞的抑制率为27%;对SMMC-7721细胞的抑制率为23%;对BGC-823细胞的抑制率为29%;对MCF-7细胞的抑制率最高,达55%。结论:建立的壳聚糖纳米粒的制备方法可靠,并证明其体外具有较好的抗肿瘤作用。     

包裹转化生长因子β1壳聚糖缓释微球的研制*

目的：制备包裹转化生长因子β1的壳聚糖微球,并分析其各种特性。 方法：将壳聚糖溶解在2%乙酸中,利用吐温-80作为乳化剂,多聚磷酸钠作为交联剂,以乳化交联法制备载有转化生长因子β1的壳聚糖微球;同时制作空壳聚糖微球以及包裹牛血清白蛋白的壳聚糖微球作为空白对照和实验对照。对获得的3种冻干微球的形态,直径大小进行观察,对转化生长因子β1壳聚糖微球的分散情况及所载药物的体外释放情况进行检测,并测定空壳聚糖微球及包裹牛血清白蛋白壳聚糖微球的吸水膨胀率。 结果：冻干后的微球经过扫描电镜观察后发现：空壳聚糖微球直径约15 μm,表面光滑,有较多微小孔隙,而包裹了牛血清白蛋白及转化生长因子β1的壳聚糖缓释微球直径约为1 μm,大小较均一,表面光滑。包裹了转化生长因子β1的壳聚糖微球在释放实验中前12 h内释放速度较快,随后趋于平缓。6 d内微球的转化生长因子β1释放率为53.5%。壳聚糖微球及包裹了牛血清白蛋白的壳聚糖微球在1 h后增加的质量基本达到平衡,均超过700%,且发现微球越是在酸性环境中,吸水膨胀率越高。 结论：实验采用乳化交联法制备包裹转化生长因子β1的壳聚糖缓释微球的方法简单易行,成球性好,得率高,具有良好的缓释效果。且壳聚糖微球的超强吸水膨胀率对软骨组织工程支架提出了孔径大小及强度的要求。 关键词：壳聚糖;缓释微球;转化生长因子β1     

兔骨髓基质干细胞的分离生长及冻存技术研究

目的：建立兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离、培养、增殖、冻存的方法，以及探讨其生物学特性。方法：抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。观察MSC的生长特性，测定其贴壁率及第3、8、13、18代的生长曲线，并评价其生物学特性。MSC在12．5％DMSO条件下经液氮或-60℃冻存复苏，测其成活率。结果：MSC为贴壁生长，以均一的梭形的成纤维细胞样生长，贴壁及增殖能力强，所测各代的生长曲线呈相似的S型，倍增时间约为35h。MSC需液氮保存，短期也可-60℃冰箱保存。结论：获得的兔MSC生长旺盛、增殖能力强，其分离、培养、纯化、增殖、冻存方法是可行的，可较长时间稳定地培养增殖、冻存，传代的MSC可保持其原代的生物学特性。MSC将是组织工程理想的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离增殖及分化潜能活性

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖的方法，并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性。方法：取SD大鼠的股骨及胫骨，冲取骨髓液，采用贴壁培养法分离纯化MSC，增殖，并测定其生长曲线。对第三代大鼠MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况。对第三代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化，测定诱导后的细胞表型情况。结果：大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长，贴壁及增殖能力强。生长曲线呈S型。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后AIP活性显著提高。并出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌异染基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论：获得的SD大鼠MSC生长旺盛，增殖能力强。在特定诱导条件下。大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞。具有成骨及成软骨分化潜能。     

壳聚糖纳米混悬剂抗突变生物学效应:原核细胞基因突变试验

背景：抗突变剂能有效阻止化学致癌物对遗传物质的损害，因此，积极寻找具有抗突变作用的生物资源具有重要的意义。目的：系统评价壳聚糖纳米混悬剂对多种强阳性诱变剂的抗突变效应。设计、时间及地点：体外对照观察试验，于2007—03/2008-03在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。材料：自制壳聚糖纳米混悬剂（平均粒径25．3nm，占总粒子数99．1％），8种诱变剂均购自美国Sigma公司。方法：用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验），将壳聚糖纳米混悬剂设定为高、中、低（2500，1250，625μg/Ⅲ）3个剂量组，分别对NaN3、MMC、9-AA、2,7-AF、NQNO、Dexon、CP、2-AF等8种常用诱变剂进行抗突变作用观察。主要观察指标：根据平均回变菌落数计算抑制率，用抑制率判断其抗突变作用程度。结果：高、中剂量组壳聚糖纳米混悬剂对NaN3、MMC、9-AA、2,7-AF、NQNO、CP和2-AF分别呈中度抑制和弱抑制，低剂量组无抑制作用。壳聚糖纳米混悬剂对诱变剂Dexon显示出较强的抗突变效应，3个剂量组对Dexon诱发的回变菌落数均显著下降（P〈0．01）。随着壳聚糖纳米混悬剂浓度的增加，对不同致突变剂产生的诱发回变菌落数明显下降，抑制率上升，呈现量效关系。结论：壳聚糖纳米混悬剂对多种诱变剂具有不同程度抗突变效应，并呈现量效关系。     

HIV流行毒株的DNA macroarray基因分型技术的研究

目的：建立一种特异、相对简便的HIV流行毒株基因分型新技术。方法：从HIV-1抗体阳性标本中提取HIV前病毒DNA。使用HIV-1型共用引物进行PCR扩增。同时设计一条型特异性的探针，然后通过制作DNA macroarray芯片，鉴别样本的HIV亚型。结果：DNAmacroarray分析可以检测我国HIV主要流行株基因型的特异性序列：B、C、CRF01-AE和CRF07-BC。结论：DNA macroarray方法对HIV亚型进行分析是可行的，可以在HIV流行病学调查中应用。     

蚕丝-PLGA编织支架生物安全性评价方法研究和应用

目的:通过动物实验评价蚕丝-PLGA细丝混合编织支架材料的生物安全性,为该材料临床应用提供理论依据。方法:通过捻拧编织蚕丝纤维-PLGA细丝混合支架,蚕丝:PLGA的质量比为2∶3。并制备该支架材料的浸提液。采用蚕丝纤维-PLGA细丝混合编织支架浸提液进行如下生物安全性的动物实验研究:急性全身毒性试验、皮内刺激试验、溶血试验、热原试验,并根据实验数据进行分析、评价。结果:蚕丝-PLGA混合编织支架材料为螺旋上升的绳索状,直径3.2 mm。支架材料无急性全身毒性作用,无皮内刺激反应。支架材料溶血率为1.17%,小于5%,不具溶血作用,符合生物材料溶血试验的要求。热原试验表明,3只实验兔体温升高数分别为0.4℃、0.2℃、0.3℃,均低于0.6℃,总值小于1.4℃,不具热原反应。结论:蚕丝-PLGA混合编织支架材料具有良好的生物相容性。符合相关生物安全性的评价标准。     

人牙周膜细胞在矿化液作用下的增殖、成骨分化与相关基因表达

目的：分离培养人牙周膜细胞（PDLCs）,观察矿化液对PDI。Cs细胞增殖和成骨分化的影响。方法：酶解组织块后获得人PDLCs,矿化液处理后观察对细胞影响。采用MTT法检测对细胞增殖;流式细胞分析细胞周期改变;分别通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色,RT—PCR观察矿化液诱导成骨分化的效果。结果：矿化液对人PDI．Cs的增殖无显著影响,高浓度地塞米松（Dex）的矿化液有一定抑制作用。含Dex的矿化液可促进成骨分化,包括ALP活性提高,矿化结节形成,以及成骨基因的表达上调。$100A4和PLAP-1是相对特异的牙周膜标志,也参与矿化液诱导的成骨分化的调控过程。结论：含地塞米松的矿化液可有效促进人PDLCs的成骨分化,对细胞增殖影响较小。PDI,Cs是一种新型的种子细胞,可应用于骨组织工程。     

兔骨髓间充质干细胞表面抗原检测及其变化特点

目的:应用流式细胞仪对兔骨髓间充质干细胞的表面抗原进行检测,观察骨髓间充质干细胞传代次数、克隆纯化与骨髓间充质干细胞表面抗原表达之间的关系。方法:实验于2004-01/2006-08在浙江省医学科学院生物工程所完成。取3月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。兔骨髓间充质干细胞的克隆化:将铺满培养瓶底的原代骨髓间充质干细胞,用D-Hanks液小心的洗1次,加入0.25%胰蛋白酶消化约4min,弃消化液,加LG-DMEM培养液收集细胞,1000r/min,离心10min,然后用LG-DMEM培养液充分混匀沉淀细胞。细胞计数后以10倍递减稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1mL稀释后的细胞悬液加入10mL培养液,使最终细胞密度为10个/mL。将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μL。置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每天观察克隆细胞的增殖生长状况。待克隆细胞生长至60%～80%融合时,逐步扩大培养,在液氮冻存保种的同时进行细胞连续传代。将体外普通法分离的骨髓间充质干细胞第5代、第7代、第13代、第16代、第21代、第22代及克隆纯化的骨髓间充质干细胞第3代、第5代、第15代、第26代均标记上CD14-FITC及CD44-PE,通过流式细胞仪检测其阴性率及阳性率。结果:①普通法分离的骨髓间充质干细胞各代的CD44表达呈阳性,且随着培养代次的增加,其表达的阳性率逐渐增强,到P16代以后又呈下降趋势;各代骨髓间充质干细胞表面抗原CD14出现了微弱阳性,但随着培养代次增加,其阳性率呈下降趋势。②克隆纯化的骨髓间充质干细胞其CD44呈现阳性,表达在80%以上,至P26代时CD44表达下降到70.49%;其CD14基本呈阴性。结论:兔骨髓间充质干细胞其CD44呈阳性表达,CD14呈阴性表达。随着传代代数增加CD14阴性符合率逐渐提高,CD44阳性表达率也提高。普通法分离的骨髓间充质干细胞较克隆纯化的骨髓间充质干细胞CD14阴性符合率差,前者的CD44阳性表达率也较后者低。