针对核干细胞因子腺病毒干扰载体构建与干扰作用观察

目的构建针对核干细胞因子(Nucleostemin)基因寂寞的RNA干扰腺病毒载体,观察其干扰作用。方法根据克隆的全长Nucleostemin基因(1 650bp,GenBank接受序号:AY825265)设计RNA干扰反向重复序列,采用分子生物学组装腺病毒载体,制备高效价RNAi重组腺病毒。实验分为Backbone-P1P2重组腺病毒感染组(P1P2干扰组)、Backbone-P3P4重组腺病毒感染组(P3P4干扰组)、Backbone空质粒病毒感染对照组(B组)和无病毒感染对照组。不同剂量腺病毒液RNAi(分别为60、30、15和7.5μL)转染F6细胞及U937细胞,采用蛋白质印迹法检测F6细胞及U937细胞中核干细胞因子的蛋白表达水平,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测U937细胞中核干细胞因子的mRNA表达水平。计数法绘制细胞生长曲线,判定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化。结果靶向核干细胞因子基因的腺病毒RNA干扰载体(Backbone-P1P2,Backbone-P3P4)被成功构建。蛋白质印迹法检测结果显示,F6细胞内不同梯度浓度腺病毒RNA干扰后,核干细胞因子表达量分别为1.23、4.48、5.03和5.75,随P3P4片段RNA干扰浓度梯度下降而核干细胞因子表达量呈上升趋势。P1P2干扰组蛋白水平为0.219±0.051,与空质粒转染对照组的2.174±0.196比较明显降低,F=279.4,P<0.001;P3P4干扰组蛋白水平为0.0164±0.003,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=363.4,P<0.001。P1P2干扰组基因表达水平为1.585±0.20,与空质粒转染对照组的3.932±0.271比较明显降低,F=145.9,P<0.001;P3P4干扰组基因表达水平为1.328±0.251,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=149.9,P<0.001。细胞周期实验发现,核干细胞因子干扰后,P1P2腺病毒RNA干扰组为44.89±4.04,与空质粒转染对照组的54.74±3.28对比减低,F=10.75,P=0.031;P3P4干扰组为45.00±3.82,与空质粒转染对照组对比减低,F=11.23,P=0.029;S期+G2M期细胞P1P2干扰组为55.11±2.81,与空质粒转染对照组的45.26±1.72对比升高,F=26.82,P=0.007;P3P4干扰组为55.00±2.64,与空质粒转染对照组相比明显升高,F=28.67,P=0.006。表明核干细胞因子在细胞周期中阻碍G2/M检验点通过。结论成功构建针对核干细胞因子基因沉默的RNA干扰腺病毒载体,该病毒载体可特异有效的沉默下调核干细胞因子基因的表达,为今后研究核干细胞因子功能奠定了基础。     

原发性肝癌中MDR1基因表达研究

探讨MDR1基因编码的P-糖蛋白（Ppg)在肝癌（HCC）及癌周正常肝组织中的表达及其临床意义。用免疫组化SABC法，检测78例肝癌及60例癌旁组织中Pgp表达，分析肝癌中Pgp表达程度和临床病理特征。（1）Pgp表达主要位于肝癌，胆管上皮细胞膜上，少量位于胞质内；Pgp表达量，在治疗前癌组织中平均为26％，而癌旁组织平均为56％以上，治疗后接近癌旁组织。（2）Pgp表达量与肝癌分化程度有关，分化程度越高，其表达量越高。（3）术后1，3，5年，Pgp高表达组生存率略高于低表达组。     

肝癌组织中内质网蛋白基因表达及其功能的初步研究

为研究肝癌中内质网蛋白基因(RTN)表达及初步功能。利用免疫组化、真核转染、体内外抑瘤试验等方法。结果显示肝癌中RTN呈下调表达，RTN蛋白主要定位于细胞浆和细胞膜，并且与肝癌的淋巴结转移有关。转染RTN后，体外肝癌细胞生长率明显减少，一些基因表达发生改变，体内肿瘤抑制率为85．64％。转染RTN细胞产生肿瘤的坏死级别较高于其它两组。RTN可能作为候选抑癌基因在肝癌发生中起重要作用。     

TRAF6在NF-κB信号通路中的修饰与降解

目的：研究肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在调节NF-κB通路中的作用机制。方法：利用转导了并稳定表达。TRAF6基因的293RZC细胞株，用荧光素酶报告基因系统测定CoA1对293RZC细胞NF-κB通路的激活，Westem Blot分析在NF-κB通路激活过程中TRAF6和IκBα的降解。结果：CoA1可诱导293RZC细胞NF-κB通路的激活，在这一过程中，TRAF6被修饰并降解，IκBα也发生降解，二者的降解被蛋白酶抑制剂MG132抑制。结论：TRAF6介导NF-κB通路的激活需要蛋白酶复合体的作用。     

启东肝癌高发区肝癌患者血清中p53突变研究

目的　研究启东地区肝癌患者血清中 p5 3基因突变 ,并确定其对肝癌诊断的意义。 方法　收集 2 5例肝癌 ,2 0例肝硬化 ,30例健康对照者的血标本 ,提取DNA ,应用限制性酶切及直接序列分析方法测定 p5 3基因第七外显子突变。 结果　显示 p5 3基因第七外显子的 2 49密码子产生突变 ,ARG变为SER ,肝癌 ,肝硬化 ,健康者中发生率分别为 44 % ( 11/2 5 ) ,2 0 % ( 4/2 0 ) ,7% ( 2 /30 ) (P <0 .0 1)。结论　启东地区肝癌患者血清中p5 3突变与肝癌发生密切相关 ,其可作为新的肝癌早期诊断标志。     

肝癌中蛋白激酶CK2α亚基的克隆及其功能初步研究

目的 克隆肝癌中CK2α基因，并研究其功能。方法 通过逆转录PCR从肝癌组织中获得CK2α亚基基因编码区cDNA。将NdeI／BamHI双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体pT7—7进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌DH5获得转化子，琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选4个阳性克隆进行DNA测序，将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL21(DE3)，挑单克隆小量培养，IPTG诱导表达，Western blot鉴定。结果 转化子的阳性筛选率为l00％，限制性酶分析结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。DNA正反向测序结果表明：从4个阳性克隆中筛选到1个PCR过程不产生突变的重组质粒，并将其质粒命名为pTMCKA。重组质粒转化表达菌经TPTG诱导后出现一个分子量42Kdα蛋白过度表达，Westen blot结果证明过度表达产物能与抗人CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应。结论 蛋白激酶CK2α亚基在肝癌中表达，并产生一定的功能。     

艾拉莫德对脂多糖激活大鼠肺泡巨噬细胞系TNFα产生及NF-κB活性的抑制作用

目的研究非甾体抗炎药艾拉莫德(T-614)对脂多糖(LPS)刺激的大鼠肺泡巨噬细胞系(NR8383)前炎症反应因子TNFα基因表达、蛋白合成的影响及其对核因子κB(NF-κB)的作用。方法体外培养NR8383经T-614(13.4，26.7及53.4 μmol·L^-1)处理，LPS刺激后应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中TNFα的水平，半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TNFα mRNA水平，ELISA法检测NF-κB的活性。结果T-614对LPS诱导的NR8383细胞TNFα mRNA水平和蛋白水平的上调有显著抑制作用，对NF-κB的转录活性也有抑制作用。结论 T-614可能通过抑制LPS诱导的NR8383的NF-κB活性而降低TNFα的产生。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

Lipocalin型前列腺素D合成酶研究进展:基因结构和理化性质

Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS)定位于人 9号染色体 (9q34 2～ 34 3)和鼠 4号染色体上 ,在单倍体基因组中为单一拷贝基因。L PGDS的结构基因约 3 6kb ,由 7个外元和 6个内元组成 ,鼠、人L PGDS结构基因与Lipocalin家族成员的结构基因十分类似。L PGDS基因启动子中心区较小 ,有一些功能尚未确定的特殊序列 ;启动子远端有甲状腺激素应答元件 ,可接受甲状腺激素的调控。L PGDScDNA有两种 ,其存在的意义尚不清楚。L PGDSmRNA编码 190个氨基酸 ,其在转运粗面内质网和高尔基复合体期间被糖基化 ;成熟L PGDS具有一定量的糖类和复合型寡糖结构 ,由 8个或 9个 β片层结构组成特定的空间结构。L PGDS代谢快速 ,主要在肝内代谢。L PGDS为一双功能蛋白 ,不仅可催化PGH2 转变为PGD2 ,亦有运输亲脂 /疏水物质的能力。     

CB-FISH法检测人体内嵌合的21号染色体非整倍体

目的　探讨 2 1三体患者体内二倍体细胞增多的机理。方法　用松胞素 - B诱导的双核细胞荧光原位杂交技术 ,对人体内 2 1号染色体非整倍体和培养细胞中 2 1号染色体分离异常的发生率进行检测。结果　 2 1三体患者体内 ,二倍体细胞率 (16 .90‰± 10 .70‰ )远高于 2 1四体细胞率 (0 .42‰± 0 .6 4‰ ) (P=0 .0 0 0 )。在培养的正常人和 2 1三体患者细胞中 ,2 1号染色体不分离率 (3.6 9‰± 2 .5 0‰和 8.2 2‰±5 .5 4‰ )显著高于丢失率 (0 .10‰± 0 .30‰和 0 .43‰± 0 .49‰ ) (P=0 .0 0 0 )。结论　 2 1三体患者体内较高比例的二倍体细胞源于因三体细胞中 2 1号染色体分离异常而形成的二倍体细胞的逐渐积累