SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

硒蛋白K在小鼠中的组织差异表达及T淋巴细胞内定位

目的检测硒蛋白K(Sel K)在小鼠脾、肾、肠、肺、脑、肝组织中的表达差异及在T淋巴细胞内的定位,为研究Sel K的分布与生物学功能的关联性提供参考。方法采用实时荧光定量PCR,Western blot以及免疫组化方法检测硒蛋白K在小鼠各组织的表达差异,并采用细胞免疫化学的方法 ,用激光共聚焦显微镜观察硒蛋白K在小鼠T淋巴细胞内的定位。结果实时荧光定量PCR结果显示硒蛋白K在小鼠各组织中均有表达,并且在脾脏中的表达明显高于其他组织(P0.05)。Western blot及免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果基本一致。细胞免疫化学结果显示硒蛋K在小鼠T淋巴细胞中定位于内质网。结论硒蛋白K是一种在脾脏中高表达的内质网蛋白。     

单标记延伸结合荧光偏振技术快速检测B型流感亚系方法的建立及应用

目的建立一种单标记延伸（OLE）结合荧光偏振技术（FP）快速检测B型流感By和Bv亚系的新方法。方法从GenBank下载By和Bv血凝素（HA）基因各50条序列,通过MEGA软件进行分析,利用PrimerPremier5．0设计B型流感病毒亚系特异性引物和单标记延伸引物,RT-PCR扩增目的片段,用OLE引物添加亚系特异性荧光标记的双脱氧核糖核苷酸,建立单碱基延伸终止荧光偏振检测方法。结果RT-PCR扩增产物的大小分别为349、397和713bp。OLEsense引物检测Bv亚系双脱氧三磷酸胸苷（ddTTP）的FP值高于双脱氧三磷酸胞苷（ddCTP）的FP值（P〈0．01）。而By亚系则正好相反,ddCTP的FP值高于ddTTP（P〈0．01）;OLEanti—sense引物检测Bv亚系和By亚系ddGTP和ddATP的FP值均差别不大（均P〉0．05）。Bv样品毒株ddTYP的FP值均值为（159±10）mp,与Bv参照株（162mp）相近;By样品毒株ddCTP的FP值均值为（163±10）mp,与By参照株（165mp）相近。结论该方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断。     

用ARIMA模型预测流感的变化趋势

目的探讨ARIMA在建立流感预测模型方面的应用。方法利用深圳市2006—2008年每周的流感样病例（ILI）监测数据建立ARIMA模型,拟合ILI％的变化趋势,用残差序列分析进行模型诊断,用2009年的数据来检验ARIMA模型的预测效果。结果2006—2008年深圳市的ILI％呈季节性周期变化,经模型诊断发现ARIMA（1,0,0）×（1,1,0）模型为最优模型,预测值与实际值的平均相对误差为14．2％。通过对2009年数据的外推,2009年上半年的平均相对误差为15．5％,下半年的平均相对误差为25．5％。结论ARIMA模型可对ILI率进行很好的拟合,建模后的中短期预测效果较好。     

疟疾高度流行区回国人员的疟疾防制对策研究

目的探讨深圳市赴疟疾高度流行区回国人员的疟疾综合防制对策,为进一步加强我市的疟疾防制工作提供科学依据。方法对我市某高新企业赴疟疾高度流行区外派人员进行出国前健康教育、出国间药物预防和回国后健康排查并对该防制对策的效果进行分析研究。结果在疟疾相关知识健康教育前后,涉外员工的教育依从性和疟疾相关知识水平有显著提高,其中问卷回收率（Х^2=21．024,v=1,P〈0．001）、疫区知识正确性（Х^2=21．213,1,=1,P〈0．001）和态度行为正确性（Х^2=15．142,v=1,P〈0．001）增高明显。被干预人员的预防药物使用率逐年上升,疟疾发病率维持在较低水平。疟疾快速筛查方法与病原学检查结果符合率高,有助于病例的早期诊断和治疗。结论深圳市针对从疟疾高度流行区回国人员的疟疾防制对策为我市和其他涉外交流频繁地区的疟疾防制提供了重要的工作经验。     

深圳市2007～2010年疟疾流行特征分析

目的分析深圳市近4年疟疾流行的特点,为科学制订防制策略提供依据。方法收集全市血检监测及疟疾发病资料,用描述流行病学方法分析疟疾病例在时间、地区和人群中的分布特点。结果 2007~2010年疟疾发病数为134例,平均年发病率为0.037/万;输入性疟疾病例为82例,占总病例数的61.2%;按地区分,报告病例数前三位依次是罗湖、宝安和龙岗区,分别为49、33和28例,南山、福田和盐田区分别为15、7和2例;病例主要集中在20~40岁年龄组,占总病例数的59.7%（80/134）;发病时间动态分布显示每年的6~8月为发病的高峰期;往来非洲、东南亚等疟疾高发地区的商务人员和从事野外作业的低收入群体为高危人群。结论深圳市本地疟疾疫情基本稳定,输入性疟疾的增加对深圳市的疟疾发病水平产生一定影响,应作为今后疟疾防治工作的重点。     

弓形虫 SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答

目的分析弓形虫 SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.方法重组表达质粒 pVAX1-SAG1瞬时转染 vero细胞, Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒 pVAX1-SAG1及空质粒 pVAX1于 0、 4周分别经肌注免疫 BALB/c小鼠;第 8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经 ConA和抗原刺激,用 MTT法测定免疫鼠脾脏 T淋巴细胞转化率 ;使用直接免疫荧光法 ,用流式细胞仪对 CD4+、 CD8+ T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.结果 Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的 26 000u的特异带,与理论值相符 ;抗原刺激小鼠脾 T淋巴细胞发生增殖反应 , 免疫组与空质粒对照组间差异有显著性 (P< 0.05),但 ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性 (P >0.05); T细胞亚群 CD4+、 CD8+动态分析 ,CD4+、 CD8+ T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性 (P1< 0.05, P2< 0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.结论 真核表达质粒 pVAX1-SAG1在 vero细胞中获得表达 ,且能诱导 BALB/c小鼠产生细胞免疫应答.     

Expression and Purification of SARS Coronavirus Membrane Protein

To construct a recombinant plasmid Pet23a-M, the gene encoding severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus membrane protein was amplified by RT-PCR and cloned into the expression plasmid Pet23a. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA sequencing analysis revealed that the cloned DNA sequence was the same as that reported. The recombinants were transformed into Escherichia coli (E. Coli) BL21 (DE3) and induced by Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of 27 kD (1 kD=0. 992 1 ku) protein was detected by SDS-PAGE and pured by metal chelated chromatography. Results of Western-blot showed that this expressed protein could react with antibodies in sera of SARS patients during convalescence. This provided the basis for the further study on SARS virus vaccine and diagnostic agents.