结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐利福平（ＲＦＰ）分离株ｒｐｏＢ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＰＣＲ－ＤＳ）分析５０株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｏＢ基因。结果３株结核分支杆菌药物敏感株和２株非ＲＦＰ耐药株中，仅１株ｒｐｏＢＳＳＣＰ图谱异常的药物敏感株出现５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ突变。４５株ＲＦＰ耐药株中，１０株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析均未见ｒｐｏＢ突变，３５株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析异常，其中１４株为５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ或ＴＧＧ或ＴＡＣ突变，１４株为５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ或ＧＡＣ或ＣＣＣ或ＣＴＣ或ＧＴＣ突变，２株为５１６位ＧＡＣ→ＧＴＣ或ＴＡＣ突变，２株为５１６位和５２６位及５１５位和５１６位密码子双点突变，３株ｒｐｏＢ序列与结核分支杆菌不同。结论大多数结核分支杆菌耐ＲＦＰ是由于其ｒｐｏＢ基因突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定结核分支杆菌ＲＦＰ耐药基因型     

应用多重PCR技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的:建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)菌株的方法.方法:依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1,RD1)的基因区,而其它牛分支杆菌菌株和其它结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息,应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否,鉴别BCG菌株与其它牛分支杆菌菌株及其它MTC菌种.RD1区编码约9.5kbDNA片段,至少含8个开放阅读框架.     

16S rRNA基因突变与结核分支杆菌耐链霉素的研究

我们已证实大多数结核分支杆菌耐链霉素（ＳＭ）是由于其核糖体Ｓ１２蛋白编码基因（ｒｐｓＬ）错义突变所致［１］，在此基础上，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ直接测序法（ＤＳ）进一步研究其１６ＳｒＲＮＡ编码基因（ｒｓ）的突变...     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

16S～23S rDNA内转录间隔区序列分析及其在分支杆菌鉴定中的应用价值

目的：研究16S－23SrDNA内转录间隔区（internal transcribed spacr,ITS)序列在分支杆菌鉴定中的应用价值。方法：应用PCR－直接测序法对22例30株分支杆菌参考菌株和16株分支杆菌临床分离菌株16S－23SrDNA ITS测序。对所测定序列以及GenBank所报道的有关序列用Clustal程序（MegAlign Package[Windows Version4.01]；DNASTAR，Madson,Wis)处理分析，计算种间相似性，用PHYLIP Package构建分支杆菌菌种聚类分析树状谱。结果：除结核分支杆菌复合群（MTC）菌种（结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌）16S－23SrDNA ITS序列完全一致外，其它分支杆菌菌种间核苷酸排列顺序及长度变异较大，种间相似性为30．4％－86．5％，聚类分析树状谱能将各分支杆菌菌种相分离，结果表明16S－23SrDNA ITS序列分析能将MTC与非结核分支杆菌（NTM）相鉴别，能将NTM鉴定至种的水平。结论：16S－23SrDNA ITS可做为分支杆菌鉴定的靶基因。     

分枝杆菌菌种的基因快速鉴定技术

目前 ,由非结核分枝杆菌引起的疾病不断增多 ,其临床表现与结核病十分相似 ,但对许多抗结核药物有一定的耐受性 ,因此临床快速检测、鉴别分枝杆菌对于疾病的治疗具有十分重要的作用。本文对分枝杆菌的基因快速检测方法进行了综述。     

PCR技术检测尿中人巨细胞病毒的方法学研究

应用ＨＣＭＶ早、晚期两对ＤＮＡ引物，建立了聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测尿中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）的方法。肾移植术后ＨＣＭＶ感染的临床尿样检测结果表明，该方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点，与血清ＨＣＭＶ－ＩｇＭ检测结果符合率为８３．３％。使用早、晚期基因组的双引物分别对临床尿样进行ＰＣＲ扩增，减少了由于自然点突变所致的假阴性，且引物与ＨＣＭＶ同属其它病毒及组织ＤＮＡ间无交叉反应；以ＨＣＭＶ组织培养液作模板，灵敏度可达６２５ｆｇ。本方法为诊断肾移植受者ＨＣＭＶ感染提供了新的手段，适于临床推广。     

rIL-2在小鼠体内抗结核菌能力的研究

用人型结核菌H_(37)RV株和耐药结核菌分别感染小鼠。5和15天后,每只小鼠以重组白细胞介素-2作肌肉注射,分5000u和10000u/只两组,连续注射10天,观察小鼠的抗菌能力。结果表明,经实验治疗后,小鼠脾脏内总菌数和活菌数明显减少。感染后于上述用药时间,剂量组之间无显著差别。     

耐吡嗪酰胺结核分枝杆菌基因突变研究

目的 研究吡嗪酰胺酶编码基因pncA突变与结核分枝杆菌吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)耐药的关系.方法 将临床分离的36株结核分枝杆菌进行常规PZA药敏试验和pncA基因序列分析.采用绝对浓度法进行PZA药敏试验;PCR扩增pncA基因及其上游、下游碱基序列,纯化回收PCR产物克隆到T载体并进行全自动测序.结果 36株临床分离株中25株PZA耐药,11株PZA敏感.5株高耐PZA(PZA浓度为250 μg/ml)临床分离株4株pncA基因突变;20株低耐PZA(PZA浓度为50 μg/ml)6株pncA基因突变;25株耐PZA结核分枝杆菌pncA基因突变率为40.0%.3株PZA敏感临床分离株pncA基因出现突变、其中2株为同义突变.11株耐PZA结核分枝杆菌pncA基因上游调控序列突变,其中5株同时有pncA基因突变;2株PZA敏感结核分枝杆菌pncA基因上游序列突变.结论 pncA基因突变可引起结核分枝杆菌对PZA耐药,但pncA基因突变只是结核分枝杆菌耐PZA的一种机制,可能还存在PZA的其他耐药机制.