双重实时逆转录聚合酶链反应检测甲型和乙型流感病毒

目的:建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)以检测甲、乙型流感病毒。方法:设计甲、乙型流感病毒M基因的特异性引物及双标记探针,优化反应条件,建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)。设计甲型流感病毒HA1、HA3亚型的H1、H3、N1、N2基因的特异性引物,建立双重普通RT-PCR(DRT-PCR)方法。对HA1、HA3和B型细胞分离株进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测。对80份发热病人咽拭子标本进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测及细胞培养分离病毒。结果:DqRT-PCR检测甲型和乙型靶DNA片段(重组质粒)最低极限为1×103拷贝。DqRT-PCR和DRT-PCR对11株H1N1、16株H3N2和12株乙型细胞分离株检测,符合率100%。DqRT-PCR、DRT-PCR和细胞培养分离病毒对80份咽拭子标本的阳性率分别为:37.5%(30/80)、30.0%(24/80)和43.8%(35/80),检出率差异未见统计学意义(2χ=5.5,P>0.05)。与细胞培养分离病毒法比较,DqRT-PCR的阳性和阴性总符合率为73.7%(59/80),阳性预测值为62.9%(22/35),阴性预测值为88.9%(40/45);经配对2χ检验,差异无统计学意义(2χ=0.76,P>0.05)。结论:建立DqRT-PCR可应用于甲型和乙型流感的检测,以多种检测方法互补将有助于提高临床标本的病毒检出率。     

临床来源nct-CTXΦ样霍乱弧菌基因的多样性分析

目的了解临床来源霍乱弧菌nct-CTXΦ(不含霍乱毒素基因的CTXΦ)样基因特征。方法对6株于2000-2004年自杭州散发腹泻患者分离的ctxA-、tcpA O1群霍乱弧菌核糖体基因分型,PCR检测zot、ace、cep基因及串联CTXΦ基因组拷贝间的相邻片段;以zot、ace、cep基因探针South- ern blot分别检测nct-CTXΦ样基因的PstⅠ、HindⅢ、MluⅠ、BglⅡ酶切及HindⅢ、MluⅠ双酶切的限制性酶切长度多态性,结合拷贝间相邻片段HindⅢ酶切位点分析,构建nct-CTXΦ样基因组物理图谱。结果6株O1群霍乱弧菌中,核糖体基因分型为2种型别;1株无CTXΦ或nct-CTXΦ样基因组,5株存在nct-CTXΦ样基因组,且此5株菌株中存在3种类型nct-CTXΦ样基因组组成,分别为单拷贝长约6 kb串联双拷贝、单拷贝长约5.8 kb的串联双拷贝和串联4拷贝(2个单拷贝长约6 kb,另2个单拷贝长约5.8 kb)。结论nct-CTXΦ霍乱弧菌可能具有引起腹泻的能力;临床和环境来源的霍乱弧菌中存在着一类多样性的nct-CTXΦ样噬菌体家族。     

口服蚓激酶微乳及其与片仔癀联用对大鼠肝纤维化的作用研究

目的：探讨蚓激酶微乳及其与片仔癀联用对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的作用研究。方法 SD大鼠采用 CCl4法诱发大鼠肝纤维化模型,SD大鼠随机分成正常组、阴性组、模型组、蚓激酶微乳组（ YR）、片仔癀组（ P）、蚓激酶微乳＋片仔癀组（ YRP）,8周末取血测定血浆丙氨酸氨基转移酶（ ALT）、天门冬氨酸转氨酶（ AST）活性。给药8周后取肝组织进行病理学相关检查以观察大鼠肝组织纤维化程度,同时进行 mmp13表达免疫组化检测。结果与模型组相比,YRP、YR、P3组血清转氨酶 ALT和 AST及其比值AST／ALT均降低,有显著性差异;YRP、P、YR组 HE染色显示的肝小叶结构破坏程度、纤维组织增生及炎性细胞浸润程度均较模型组轻,其中YRP组表现更甚;YRP、P、YR组 mmp－13免疫组化胞浆棕黄色着色明显增多,提示mmp－13表达皆高于模型组,有显著性差异,YRP组仍强于 P组和 YR组。结论片仔癀或蚓激酶微乳对改善大鼠肝纤维化程序有一定的抑制作用,片仔癀与蚓激酶微乳联合用药对大鼠肝纤维化有较明显抑制作用。     

多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因

目的 建立多重实时PCR检测志贺毒素（stx1、stx2）基因和紧密素基因（eae）的方法。方法 优化多重实时PCR反应条件，检测系列稀释的阳性菌DNA提取物及纯化阳性质粒。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌株，并比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和DNA提取方法，选出最适方法。同时用该方法对36份腹泻患者粪便标本进行直接检测且对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10^1拷贝／pJ的毒力基因和10。CFU／p．1的DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌的阳性和阴性符合率均为100％。粪便样品的DNA提取以BP肉汤增菌6h后煮沸提取效果最好。36份腹泻患者粪便中2份eae阳性，均鉴定为大肠埃希菌。结论 建立的同时检测stx1、stx2、eae基因的多重实时PCR方法，具有较高的敏感性，可用于产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。