急性缺血缺氧大鼠肠上皮细胞线粒体ATPase6基因的表达研究

目的研究急性缺血缺氧大鼠线粒体ATPase6基因表达的变化,探讨急性缺血缺氧引起肠上皮细胞线粒体损害的分子机制.方法(1)动物模型通过失血性休克大鼠造成急性缺血缺氧模型.Wistar大鼠随机分成正常对照组与失血性休克组.按Wigger法放血至平均动脉压5.33kPa,维持低血压2h,造成急性缺血缺氧,分别于失血性休克后2h、3h、5h活杀动物.(2)肠线粒体ATPase6基因表达测定活杀动物后取回肠5cm,制备肠上皮细胞悬液,并将细胞数调至1×109/L,用异腈酸胍盐酸盐法提取细胞总RNA.紫外测定RNA纯度和含量,并进行RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳以鉴定其完整性.RT-PCR法使用宝灵曼试剂盒.上游引物5'-AAACGAATAACCCTTGAGAATC-3',下游引物5'-TGGTGGGTCATTATGTGTTATC-3',特异扩增715bp大鼠线粒体ATPase6cDNA片段.(β-actin作对照).PCR反应体系为50μL,包括10μLcDNA,2μL上游引物,2μL下游引物,5μL10×Taq酶buffer,4μLdNTP,3.6μLMgCl2,22μLDEPC水.扩增条件95℃变性40s,55℃退火30s,72℃延伸36s,30个循环后,再在72℃下延伸9min.扩增产物行电泳照像分析.PCR产物为715bp.结果大鼠肠线粒体ATPase6mRNA在急性缺血缺氧后2h表达显著减少,并随休克加重而加重.讨论能量代谢降低是线粒体损伤的重要指标.线粒体重要功能是氧化磷酸化,即底物被呼吸酶氧化,并与之相偶联的磷酸化酶系统从而释放ATP,推动细胞的各种生命活动.ATPase6基因是编码ATP合成的F1F0-ATPase复合物的一部分,因此,研究ATPase6基因改变在能量代谢的改变中是十分重要.我们的研究发现失血性休克晚期,ATPase6基因表达减弱,与在失血性休克缺血缺氧时F1F0-ATPase早期升高,晚期降低,质子转运下降,ATP缺乏是一致的.我们在失血性休克肠上皮细胞线粒体DNAATPase6基因测序研究中发现缺血缺氧时存在硷基突变及编码氨基酸的改变,进而影响F1F0-ATPase蛋白的功能和ATP的合成.故失血性休克后,如何保护线粒体功能,尽早改善缺血缺氧是救治的关键.结论失血性休克后线粒体ATPase6基因表达在肠道损害中起一定作用,其产生与休克后急性缺血缺氧有关.     

观察HSAD对高原大鼠失血性休克合并肺水肿的疗效

目的　探讨小剂量高渗氯化钠 /醋酸钠 /右旋糖酐 4 0 (5 %氯化钠 /3.5 %醋酸钠 /6 %右旋糖酐4 0 ,HSAD)溶液对初进高原大鼠失血性休克合并肺水肿的治疗作用。方法　初进高原 (西藏拉萨海拔 36 5 8米 )SD大鼠 71只 ,戊巴比妥钠腹腔麻醉 ,维持血压在 5 0mmHg(6 .6 7kPa) ,加油酸 (5 μl/1 0 0gwt,iv) 1小时 ,复制失血性休克合并肺水肿模型 (正常对照组不放血不给油酸 )。第一部分实验 35只大鼠随机分为 5组 (每组 7只 ) :正常对照组、单纯失血性休克组、失血性休克合并肺水肿组、平衡盐液治疗组、HSAD治疗组。观察治疗后 1 5、30、6 0分钟和 1 2 0分钟的血流动力学指标变化 ,以及 30分钟和 1 2 0分钟的血气指标变化以及 1 2 0分钟肺脑含水量变化。第二部分实验 36只大鼠 ,观察HSAD对失血性休克合并肺水肿大鼠存活时间的影响。结果HSAD(4ml/kg)可显著提升失血性休克合并肺水肿大鼠平均动脉压 ,改善其左室内压 (LVSP) ,左室内压最大变化速率 (±dp/dtmax)和动脉血气指标 ,降低肺脑含水量 ,明显延长动物存活时间 ;而等容量平衡盐液无明显疗效。结论　HSAD有较好的治疗高原失血性休克合并肺水肿的作用。     

海水浸泡失血性休克条件下磷脂酶A_2的变化

海水浸泡失血性休克条件下磷脂酶Ａ２的变化第三军医大学大坪医院野战外科研究所（重庆４０００４２）李萍刘建仓陆松敏贾后军万志红磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）是特异性的水解酶，它在机体各组织细胞中广泛分布，血清中ＰＬＡ２活性的升高与循环衰竭、血压下降和休克的严重程...     

低温海水浸泡失血性休克大鼠血液动力学变化

目的　研究低温海水浸泡对失血性休克动物血液动力学的变化。方法　 41只雄性大鼠分为六组 :陆地轻度失血性休克组 ;陆地中度失血性休克组 ;陆地重度失血性休克组 ;海水浸泡轻度失血性休克组 ;海水浸泡中度失血性休克组 ;海水浸泡重度失血性休克组。运用四道生理记录仪观察伤前、伤后即刻、10、30、6 0、90分钟动物血液动力学的变化。结果　海水浸泡失血性休克动物心率显著减慢 ,LVSP、±dp/dtmax均比对照组非常显著下降 ,海水浸泡早期血压升高 ,但很快下降 ,且低于对照组。结论　低温海水浸泡使失血性休克动物血液动力学状态明显恶化 ,死亡率大大增加     

失血性休克大鼠血管扩张刺激磷蛋白磷酸化在肠屏障功能障碍中的作用

目的 观察失血性休克大鼠血管扩张刺激磷蛋白(VASP)磷酸化在肠屏障功能障碍中的作用.方法 采用40只Wister大鼠,观察不同休克时相点(1、2、4 h)VASP磷酸化和肠屏障功能变化(以小肠黏膜组织形态、血浆D-乳酸含量反映),及VASP磷酸化激动剂环磷腺苷(cAMP)对休克2 h肠屏障功能的影响.结果 (1)正常组VASP磷酸化水平很低(0.021 ±0.004),休克1 h时增高(0.145 ±0.011)(P＜0.01),2 h后降低(0.108 ±0.010)(P＜0.01);休克1 h肠屏障功能变化不明显,2 h后肠屏障功能显著降低.(2)VASP磷酸化激动剂cAMP可增强休克2 h小肠上皮组织VASP磷酸化(0.169 ±0.030)(P＜0.01),减轻肠屏障功能损伤.结论 VASP磷酸化可能对失血性休克大鼠肠屏障功能有保护作用.     

血管扩张刺激磷蛋白在失血性休克肠屏障功能障碍中的作用

目的 观察大鼠小肠上皮血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP)在失血性休克肠屏障功能障碍中的作用.方法 实验分为正常组、休克1、2、4 h组及休克2 h+环磷腺苷组,每组8只.测定各组血清二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)活性、血浆D-乳酸含量,并观察其与VASP表达的关系.结果 VASP磷酸化激动剂环磷腺苷可明显增强失血性休克2 h时VASP表达,降低血清DAO活性和血浆D-乳酸含量,与未加环磷腺苷组比较差异有统计学意义(t=18.62,9.28,2.83,P<0.05).失血性休克后大鼠血清DAO活性显著增高,而VASP表达明显降低,两者旱负相关(r=-0.95,P<0.05).结论 VASP降低是导致失血性休克大鼠肠屏障功能障碍的因素.环磷腺苷能改善肠屏障功能障碍.     

家兔内毒素血症时肝肾心肺线粒体磷脂酶A_2及其膜流动性的改变

本研究采用家兔内毒素休克模型,实验分为四组:对照组;内毒素血症组;磷酸氯喹(CQ)预处理组;地塞米松(DXM)预处理组,测定血浆和肝、肾、心、肺线粒体PLA_2活性及线粒体膜流动性。结果表明正常对照和注射内毒素(ET)后1、3、5、8h血浆PLA_2分别为15.52±5.31与25.83±7.86、30.54±11.53、37.13±8.53、41.88±7.32U/ml,注射ET后血浆PLA_2显著高于注射前(P<0.05)。CQ、DXM预处理组则血浆PLA_2显著低于内毒素血症动物(P<0.05)。注射ET8h后肝、肾、心、肺线粒体PLA_2活性显著高于正常对照组。而CQ、DXM预处理组显著低于内毒素血症组(P<0.05)。同时内毒素血症组肝、肾、心、肺线粒体膜流动性降低,分子排列有序性升高,膜脂区微粘度升高;而CQ、DXM预处理组肝、肾、心、肺线粒体膜流动性显著改善。线粒体PLA_2升高和膜流动性降低呈显著正相关。     

缺氧复氧对IEC-6肠上皮细胞膜电位的影响及紫芪方的保护作用

目的观察缺氧复氧对IEC-6肠上皮细胞线粒体膜电位的影响,探讨抗休克复方中药-紫芪方对IEC-6肠上皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用机制。方法建立IEC-6细胞缺氧复氧损伤模型;采用血清药理学方法,在细胞培养液中加入不同给药剂量获取的“紫芪方”药物血清(分别以10、20g·kg-1分为1次给药和间隔1h、2次给药,DJ-1,SJ-2);参附药物血清(间隔1h,2次给药20g·kg-1SF)及生理氯化钠血清(S)。采用紫外分光光度分析法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,以及采用激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位(MMP)变化。结果IEC-6细胞缺氧复氧损伤后,可致细胞LDH的漏出量明显升高,线粒体膜电位明显降低。紫芪方药物血清明显减轻上述损伤,与对照组比较,SJ-2组制备的药物血清能明显减少IEC-6细胞LDH的漏出量(P<0.01);并具有保护IEC-6肠上皮细胞线粒体膜电位的作用(P<0.01)。结论缺氧复氧可导致IEC-6肠上皮细胞LDH漏出量升高和线粒体膜电位降低,“紫芪方”药物血清可减少细胞LDH漏出量及保护线粒体膜电位,从而发挥细胞的保护作用。     

线粒体DNA提取方法的比较

目的将提取线粒体 DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较 ,以得到最方便快速提取线粒体 DNA的方法。方法分离 Wistar大鼠小肠上皮细胞 ,用 3种方法提取线粒体 DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体 ATPase 8亚基基因 PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体 DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体 DNA量最多 ,Triton法最少。 OD2 6 0 / OD2 80均在 1.78～ 1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体 DNA用于PCR扩增 ,测定出了线粒体 DNA ATPase 8亚基基因序列。结论改进高盐沉淀法提取线粒体 DNA具有操作简单 ,产量多的优点 ,该法所提取 mt DNA可用于 mt DNA测序     

失血性休克条件下心肌细胞动作电位和心肌力学的改变的研究

家兔失血性休克低血压5．3KPa观察3h，测定平均动脉压（MBP）、左心室收缩压（LVSP）、左心室最大收缩速度（dp／dtmax）以及心肌细胞电生理和组织内外钾钠。结果说明：（1）失血性休克后LVSP下降，且和MBP平行，（2）dp／dtmax在失血性休克后即刻急剧下降，15min后上升48％，以后逐渐下降，3h降至对照值的20％；（3）休克时细胞外钾钠显著升高；（4）心肌细胞静息电位（RP）、动作电位振幅（APH）下降；动作电位复极时间（APD），动作电位复极50％时间（APD50），复极90％时间（APD90）显著延长。提示；心肌细胞快钠通道关闭、慢钠和慢钙通道开放，钠、钙内流，钾外流。