染性法氏囊病病毒分离株变异的研究

为了了解我国传染性法氏囊病病毒(IBDV)的变异现状,并为研究高效疫苗打下基础,用琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE和序列分析等分子生物学方法,分析IBDV病毒RNA,结构蛋白的变异情况。结果表明⑴3种不同源IBDV均由双节段RNA组成,大小基因片段的电泳迁移率各病毒间无差异;⑵不同源IBDV的结构蛋白带谱相同,但各蛋白带的百分含量有差异;⑶IBDV血清Ⅰ型不同亚型的JS3和JS4毒株主要保护性抗原VP2高变区核酸序列的同源性最高达98%,与已发表的vvIBDV,IBDV变异株,IBDV经典株及IBDV弱毒株核苷酸序列同源性在92%～98%之间。根据IBDV的大开放读框推导出该片段编码蛋白的氨基酸序列,JS3和JS4的同源性最高达97%,与上述其它毒株的同源性在91%～97%之间;七肽区的氨基酸序列,在强毒株完全相同,而在弱毒株有一个丝氨酸突变成其它氨基酸。     

用原位RT-PCR分子杂交定位检测螨(革螨、恙螨)原代培养细胞内HV-RNA的研究(Ⅱ)

目的　研究革螨、恙螨在传播肾综合征出血热病毒 (Hemorrhagicfeverwithrenalsyndromevirus,HFRSV)中的媒介作用。方法　采用革螨、恙螨饲养繁殖的子代幼虫、若虫和成虫 ,消化后作螨细胞原代培养制螨细胞片 ,用原位RT -PCR分子杂交法检测HV -RNA在螨组织细胞内分布和定位。结果　HV -RNA多分布于螨消化系统的上皮细胞 ,卵巢组织细胞内 ;革螨子 4代、子 3代和恙螨若虫组织细胞内HV阳性颗粒较革螨子 2代、子 1代和恙螨幼虫多且密集。结论　革螨、恙螨作为HFRS的生物学媒介有细胞分子水平的直接证据。     

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。     

猪囊虫DNA疫苗在猪体内的组织分布及其安全性探讨

研究猪囊虫DNA疫苗pVAX-S-△c-3n在仔猪体内的组织分布情况，并对其安全性进行分析。将猪囊虫DNA疫苗以肌注方式免疫仔猪，分别于接种后1d，7d，4w，8w，12w分离各组织，提取组织总DNA，用PCR法扩增质粒上抗原基因的部分序列，分析质粒DNA在不同组织内的分布及随时间变化的情况。结果表明接种后第一天，除了脑，其余组织都能检测到质粒，但随时间延长，仅注射部位能检测到质粒，且数量不断下降。肌注质粒在猪体内注射部位以外的组织中较短时间就被清除，因此质粒与染色体发生整合的可能性不大。     

PTEN在子痫前期胎盘滋养细胞浸润不足中的作用及机制研究26

目的:检测子痫前期(PE)患者胎盘组织中PTEN表达,探讨PTEN对滋养细胞迁移功能的调控及其可能机制.方法:收集重度PE患者和正常孕妇的胎盘组织各20例,实时定量PCR和Western blot法检测胎盘组织中PTEN表达;将PTEN过表达质粒(pcDNA3.1-HA-PTEN)或特异性siRNA(siPTEN)瞬时转染至HTR-8/SVneo细胞,同时转染pcDNA3.1或siCTL作为对照.采用划痕实验评估细胞迁移能力,Western blot法检测p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、Akt、MMP-2和MMP-9表达.结果:重度PE患者胎盘组织中PTEN mRNA和蛋白表达明显高于正常孕妇,差异均有统计学意义(P<0.01).与转染pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-HA-PTEN瞬时转染HTR-8/SVneo细胞48 h后,细胞迁移率明显降低[(26.42±6.68)%vs(52.92±6.71)%,P<0.01],p-Akt(Thr308)和p-Akt(Ser473)表达显著下调,Akt表达无明显改变,MMP-2和MMP-9蛋白表达下降;与转染siCTL组比较,siPTEN瞬时转染HTR-8/SVneo细胞48 h后,细胞迁移率则明显升高[(50.39±6.84)%vs(30.04±5.40)%,P<0.01],p-Akt(Thr308)和p-Akt(Ser473)的表达明显上调,Akt表达无明显改变,MMP-2和MMP-9蛋白表达升高.结论:重度PE患者胎盘组织中PTEN表达明显升高,PTEN可通过下调Akt活性降低MMP-2和MMP-9表达,抑制滋养细胞的迁移.提示PTEN在PE的发病中发挥了一定的作用.