汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的组织细胞培养研究

目的了解汉坦病毒（HV）和恙虫病东方体（Ot）在宿主体内共生情况.方法采用Vero E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内共生特征.结果5组感染Vero E6细胞体外培养检测结果发现：先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加.而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加.在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组.其结果均用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定.结论研究结果提示HV和Ot可在同一宿主细胞内共生,在感染初期有相互抑制作用;对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义.     

大肠杆菌表达系统的研究进展

近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。     

用螨原代培养细胞检测螨体内汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的研究

目的研究汉坦病毒（Hantavirus，HV）和恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot）能否同时共生于同一媒介小盾纤恙螨（Leptotrombidium scutellare）体内。方法采集HFRS和恙虫病混合感染疫区鼠体恙螨和游离恙螨饲养的幼虫、若虫、成虫，蛋白酶消化后作螨细胞原代培养细胞片，用原位RT-PCR分子杂交和PCR法分别检测HV和Ot在培养螨细胞内的分布和定位。结果HV和Ot在感染的螨细胞中多分布于消化系统的上皮细胞、卵巢组织细胞内，且随传代次数的增加而阳性率增高。结论小盾纤恙螨可同时自然感染HV和Ot。     

基于新一代测序的SNP单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症PGD中的应用

目的探讨基于新一代测序(NGS)的单核苷酸多态性(SNP)单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症(CCA)种植前遗传学诊断中的有效性。方法对活检的滋养层细胞采用多重置换扩增(MDA)的方法扩增全基因组,应用基于NGS的SNP单体型分析和直接测序两种方法对MDA产物进行CCA的种植前遗传学诊断(PGD)。结果应用MDA方法对活检的4枚囊胚的滋养层细胞成功地进行了全基因组扩增;通过基于NGS的SNP单体型分析发现,其中两枚是未感染CCA的囊胚,另两枚是感染CCA的囊胚;单体型分析结果与直接测序法结果一致。取卵5个月后患者移植一枚基因型正常的冷冻囊胚,于妊娠的第38周经剖宫产成功分娩一体重为2 850g的健康婴儿。结论基于NGS的SNP单体型分析是单基因病的种植前遗传学诊断的有效筛查工具。     

用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因

目的与方法使用连续长片段RT-PCR,扩增HCV的结构基因。结果利用连续长片段RT-PCR技术,结合热启动和两段PCR一次扩增出长2.3kb的HCV结构基因和部分调控序列,并用测量分子质量和限制性酶切的方法进行了鉴定。结论利用长片段RT-PCR可一次扩增出C、E1、E2基因和部分5'-NTR。     

不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白表达差异性研究

目的:了解不同传染性腔上囊病病毒株(ICBDV)结构蛋白表达的差异.方法:将在不同时间、地域,从鸭、麻雀及传染性腔上囊病发病鸡群中获得的18株ICBDV,分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增生,经氯仿处理后,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒,并对纯化病毒进行SDS-PAGE分析.结果:病毒主要分布于40%蔗糖层;鸡源、鸭源、麻雀源ICBDV在SDS-PAGE中均出现5条特异的蛋白带,各蛋白带的电泳迁移率毒株间差异不明显;15株鸡源ICBDV结构蛋白VP2在不同毒株表达量有较大差异.结论:不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白VP2表达量存在差异.     

江苏省宜兴地区丙型肝炎病毒基因分型研究

目的了解江苏省宜兴地区丙型肝炎病毒（HCV）基因型分布特征和病毒变异情况。方法对宜兴市人民医院收治的158例HCV抗体阳性患者血清进行HCV RNA检测，对阳性标本进行Simmonds分型，采用5’非编码区（5’NCR）1、2、3、1b型特异性引物进行PCR扩增，并对1b型和2型各1株的PCR产物测序验证。分析不同性别、临床类型的丙型肝炎患者基因型分布差异。结果158份血清中，有95份为HCV RNA阳性，其中1b型80份（84．2％），2型5份（5．3％），1b／2型的混合感染5份（5．3％），不能分型的5份（5．3％），1b型的序列与GenBank J-4株的同源性为99．2％，2型与GenBank J-6株的同源性为97．7％。男性和女性在基因型总体分布上存在差异（P〈0．05），并且在单一型感染和混合型感染的分布上差异亦有统计学意义，不同临床类型的丙型肝炎中HCV基因型分布未显示差异。结论江苏省宜兴地区HCV以1b型为主，男女患者HCV基因型分布差异有统计学意义，而不同临床类型的HCV基因型分布无显著差异，基本反映了本地区HCV感染的特点。     

杆状病毒早期启动子载体的构建及报道基因的表达

目的 :用苜蓿尺蠖核多角体病毒 (Ac NPV)的 IE1基因启动子构建杆状病毒早期基因启动子载体。　方法 :以 Ac NPV p10基因为侧翼序列 ,并将新霉素抗性基因 (neo)插入 IE1基因启动子下游 ,得到转移载体 p Ac PIneo。将它和野生型 Ac NPV DNA共转染昆虫细胞 Sf9,由于 neo基因的表达 ,通过 G418的选择和富集作用 ,得到重组病毒 v Ac PIneo的纯培养。　结果 :用酶切和 Southern印迹杂交证明 ,neo基因整合于 Ac NPV基因组的 p10基因位相。　结论 :成功地构建了杆状病毒早期启动子载体 ,neo基因在受染细胞内从早期到晚期均可发生转录     

原核和真核细胞表达HBeAg的应用研究

目的：将原核细胞和真核细胞分别克隆表达生产的HBeAg,经适当纯化后进行检测分析,并在乙型肝炎抗HBe检测中进行应用和比较。方法：分别用大肠杆菌和家蚕细胞表达生产HBeAg,并用Saphacryl S-200柱层析进行纯化;紫外分光光度法测定表达产物的蛋白含量;EIA法测定HBeAg和HBcAg效价及评估HBeAg的应用效果。结果：原核细胞HBeAg：比活性为10000／mg,HBeAg/HBcAg＝50,用于抗HBe的检测时特异性为96％,灵敏度符合国家卫生部panel要求,真核细胞HBeAg：比活性为160000／mg,HBeAg/HBcAg＝5000,用于抗HBe的检测时特异性为100％,灵敏度高于国家卫生部panel要求的1－2个滴度。结论：真核细胞表达的HBeAg比活性高HBcAg含量低,在抗HBe检测时的应用效果优于原核细胞。     

survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对人胃癌细胞株中survivin表达的影响

背景:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,在胃癌组织中高表达。目的:构建survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并观察其对人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中survivin表达的影响。方法:根据GenBank中survivin基因序列设计并合成能转录shRNA的双链DNA序列,插入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNA-shSUR。重组载体经鉴定后转染胃癌细胞株BGC823和SGC7901,以转染pRNA-shControl作为阴性对照。荧光显微镜下观察转染情况,蛋白质印迹法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测胃癌细胞凋亡情况。结果:成功构建了针对survivin基因的shRNA表达载体。转染胃癌BGC823和SGC7901细胞48 h后,与阴性对照组相比,pRNA-shSUR组GFP表达增强,survivin蛋白表达受到明显抑制(P<0.05),胃癌细胞早期凋亡率明显增加。结论:成功构建靶向survivin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染胃癌细胞后可抑制survivin蛋白表达并促进细胞凋亡,为进一步研究survivin基因与胃癌生物学行为以及化疗耐药等的相关性奠定了基础。