跨膜型SCF与分泌型SCF对肥大细胞生物学功能影响的研究①

目的比较两型SCF对肥大细胞增殖,分泌组胺及产生细胞因子等功能的影响,探讨二型SCF在对肥大细胞生物学功能影响的异同.方法用MTT法,荧光法和原位杂交法分别检测二型SCF对肥大细胞的增殖作用,组胺分泌及TNF-αmRNA的表达.结果分泌型SCF可明显促进肥大细胞增殖,组胺分泌及TNF-αmRNA的表达;而跨膜型SCF则仅对组胺分泌有较弱的促进作用,对肥大细胞的其他两项功能无影响.结论二型SCF对肥大细胞生物学功能的影响存在差异.     

人可溶性TNF受体Ⅱ克隆﹑原核表达与活性鉴定

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)原核基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达之.方法采用RT-PCR技术,从人外周血的单核细胞中扩增出肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)基因的胞外区,将其克隆入pET28a(+)高效表达载体进行诱导表达,并对表达产物进行纯化及鉴定.结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,转入外源基因的大肠埃希菌BL21(DE3)可高效表达sTNFRⅡ蛋白,SDS-PAGE显示在32 kD处有一特异表达条带,其表达量占菌体蛋白总量的30%左右.纯化的sTNFRⅡ经Western blot鉴定具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示它可有效地封闭分泌性肿瘤坏死因子α(sTNF-α)对L929细胞的胞毒效应;直接免疫荧光显示它可以特异性抑制GFP-sTNF-α与靶细胞肿瘤坏死因子受体的结合.结论通过基因工程技术获得了人sTNFRⅡ的重组蛋白.     

人肿瘤坏死因子-α的免疫PCR检测方法

将PCR技术的极高灵敏度与ELISA技术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗原的特异性相结合,利用生物素标记的腺病毒六邻体基因重组质粒(AdAT)作为PCR的模板DNA,以链亲和素(strep-tavidin)作连接分子,与生物素标记的兔抗鼠IgG抗体相连接,后者再与TNF-α的单克隆抗体结合。设计一对扩增六邻体基因的引物进行PCR,通过对DNA扩增片段浓度的定量分析,替代ELISA方法中的酶-底物显色反应而建立TNF-α的免疫PCR检测方法。结果表明,该技术灵敏度比ELISA方法灵敏10~3倍,可检出100fg/ml的TNF-α。借助此方法可检出脑脊液中极微量的TNF-α。     

稳定转染TNFα及其突变体的骨肉瘤细胞生物学功能的研究

目的建立转染2种TNFα基因(野生型TNFα和跨膜型TNFα突变体)的MG63细胞株,研究所转染细胞的TNFα的生物学效应。方法采用逆转录病毒载体,将2种TNFα基因导入人骨肉瘤细胞MG63中,采用流式细胞术、ELISA和生物学活性检测等方法从蛋白表达及其生物学活性2个方面对转染细胞进行检测鉴定。结果野生型TNFα和跨膜型TNFα突变体分别在MG63细胞中得到有效表达,并具有生物学活性。结论获得2种稳定表达TNFα的人骨肉瘤细胞株,为进一步研究TNFα的各种生物学行为和探索骨肿瘤的基因治疗奠定基础。     

转染TNF-α及其突变体的成纤维细胞的杀瘤效应

目的:比较跨膜型和分泌型TNF－α在体内的抗瘤效应。方法：将3种TNF－α基因（分泌型TNF－α突变体，S－TNFm、跨膜型TNF－α突变体，TM－TNFm和野生型TNF－α，Wt-TNF)通过逆转录病毒载体转染成纤维细胞NIH／3T3；并用Southern印迹、RT－PCR、流式细胞仪和生物活性检测等方法，从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面对转染细胞进行检测鉴定。在小鼠接种肿瘤细胞的第3天，于接种部位分别皮下注射表达TNF－α及其突变体的NIH3T3细胞，效／靶比为5：1或1：1，观察这3种TNF－α的体内抗瘤效应。结果：NIH3T3转染细胞可表达高水平的TNFα及其突变体。在体外，NIH3T3／TM－TNFm的固定细胞，NIH3T3／S－TNFm的上清、NIH3T3／Wt-TNF的固定细胞和上清均可有效杀伤肿瘤细胞H22。在体内，当效／靶比为5：1时，注射NIH3T3／TM－TNFm的抑瘤效果最强；而当效／靶比为1：1时，则NIH3T3／S－TNFm的疗效最好。此外，在过继治疗期间未见明显副作用。结论：上述结果提示跨膜型和分泌型TNF－α均可在体内有效杀瘤；但如效／靶比 适当，TM－TNF－α显示的杀瘤效应较S－TNF－α更强。     

肌动蛋白样分子参与TNFRⅡ介导的TM-TNF-α杀瘤活性的研究

目的　寻找并研究参与TM TNF α杀瘤的协同分子 ,进一步揭示TM TNF α发挥生物学作用的特征 ,阐明其与S TNF α功能差异的分子机制。方法　利用免疫共沉淀法、质谱分析、Westernblot及细胞毒实验探索参与TM TNF α杀瘤功能的协同作用分子并确定其性质。结果　TM TNF α免疫共沉淀产物中发现一相对分子质量 (Mr)为 4 3× 10 3蛋白分子 ,用质谱分析及Westernblot证实该分子属于肌动蛋白家族 ;用抗肌动蛋白抗体封闭效应细胞和 或靶细胞后 ,TM TNF α对主要表达TNFRⅡ的肿瘤细胞HL 6 0的杀伤作用显著下降 ,而对主要表达TNFRⅠ的肿瘤细胞MCF 7则无影响。结论　Mr为 4 3× 10 3的肌动蛋白样分子可能参与并增强TM TNF α通过TNFRⅡ介导的杀瘤功能。     

人跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)特异性单克隆抗体的制备、鉴定及功能初探

目的：制备TM-TNF-α特异性单克隆抗体，并进行鉴定和初步功能分析。方法：用表位预测软件选定TM-TNF-α特异的20个氨基酸多肽，偶联载体蛋白，免疫BALB/c小鼠；用杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用ELISA、流式细胞术和Western blot鉴定单抗的特异性，观察单抗对Jurkat细胞在AICD模型中凋亡率的影响。结果：成功制备了6株抗TM-TNF-α的单克隆抗体。ELISA结果显示6株单抗均特异性结合免疫原多肽，与S-TNF-α等细胞因子无交叉反应；流式细胞术显示6株单抗均能结合细胞膜表面TM-TNF-α分子，并可区分人源和鼠源TM-TNF-α；Western blot结果证实6株单抗只能识别26kD的人TM-TNF-α，而不识别17kD的S-TNF-α。在AICD模型中，单克隆抗体不影响Jurkat细胞凋亡率。结论：成功制备了6株TM-TNF-α特异性单克隆抗体，且单抗不干扰TNF-α与TNFR结合，为进一步研究TM-TNF-α在相关疾病中的作用提供又一研究手段。     

TM-TNF-α模拟肽P18和S-TNF模拟肽P12的体外生物学活性的鉴定

目的：获得具有生物学活性的跨膜型TNF-α（TM-TNF-α）模拟肽。方法：以噬菌体扩增及PEG／NaCI沉淀法，大量制备所需的噬菌体展示肽。采用细胞毒实验、RT-PCR、Western blot印迹、凋亡检测实验分别检测TM-TNF-α模拟肽的杀瘤效应、对SODDmRNA表达水平、NF-κB核转位及致死亡方式的影响。结果：噬菌体展示肽P12和P18分别能模拟sTNF-α和TM-TNF-α的生物学活性。结论：获得能模拟TM-TNF-α的生物学活性的展示肽，为TM-TNF-α用于临床抗瘤治疗提供新线索。     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

红细胞衰老过程中临床血液参数,红细胞免疫粘附功能的改变及其临…

选用１４例青年人及１７例老年人的血样品，采用聚蔗糖密度度离心方法，获得表青龄红细胞及龄红细胞，并分别测定青龄龄红细胞的血液参数及免疫粘附功能。结果发现：ａ．血液参数的变化：老龄红细胞的平均体积变小；平均血红蛋白含量增加；血红蛋白浓度增加；体积分布宽度增国