小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立及生物学特性研究

目的：建立小鼠宫颈癌肿瘤细胞系。观察其生物学特性。方法：采用肿瘤原代培养法对小鼠U14肿瘤进行体外传代培养，定期对培养细胞进行形态学观察．进行免疫组织化学鉴定、细胞周期检查、染色体检测、细胞生长测定，进行615、C57BL／6j小鼠移植观察体内成瘤情况，并用pEGFP-N1质粒转染U14细胞。结果：细胞呈贴壁和悬浮混合生长，CK阳性特征。体外连续培养10个月，传代50代，细胞倍增时间为21．83h，细胞周期测定G1期为34％，G2期为26．4％，S期为39．6％。培养U14细胞3-4天处于对数生长期，染色体为亚四倍体核型，众数为64～84条。615小鼠、C57BL／6j小鼠移植成瘤率均为100％．无支原体污染。建立了GFP（＋）的U14-GFP单克隆细胞株。结论：成功建立了小鼠U14子宫颈癌细胞系及GFP标记的U14-GFP细胞株，体内移植可建立常规及带荧光标记的肿瘤模型，可用于体内体外相结合的肿瘤研究。     

抗CD20单链抗体融合显性抗原肽的原核表达和其抑瘤活性研究

目的:人工设计并表达美罗华(C2B8)单链可变区抗体与李斯特菌溶细胞素O(Listeriolysin O,LLO)显性抗原表位构成的重组融合蛋白(Sc Fv-p LLO),初步分析其抗淋巴瘤细胞活性。方法:查询数据库获得美罗华(C2B8)单抗VH和VL基因序列,构建抗CD20单链抗体(Sc Fv)基因序列,选取LLO的2个CD4+T细胞表位,构建单链抗体融合抗原表位的重组蛋白基因序列,克隆至原核表达载体,经诱导表达纯化,流式细胞术和免疫共沉淀分析其与淋巴瘤细胞结合能力,细胞增殖实验测定其对淋巴瘤细胞生长的影响,凋亡实验分析其诱导淋巴瘤细胞凋亡的能力,淋巴细胞增殖实验分析其免疫原性。结果:成功诱导表达重组蛋白Sc Fv-p LLO。Sc Fv-p LLO可不同程度地靶向结合不同淋巴瘤细胞系,并明显抑制Raji细胞生长和诱导其凋亡。Sc Fv-p LLO可刺激免疫小鼠脾细胞增殖。结论:重组蛋白Sc Fv-p LLO保留了Sc Fv的功能,可靶向结合和抑制CD20阳性淋巴瘤细胞的生长,同时可激活机体免疫应答,为进一步研究其模拟瘤细胞表面抗原和作为瘤细胞疫苗佐剂的功能奠定基础。     

猿猴病毒40 T抗原转化的人脐静脉内皮细胞系PUMC-HUVEC-T1的建立

目的 建立猿猴病毒40（SV40）T抗原转化的人脐静脉内皮细胞（HVUEC）模型,为内皮研究提供可利用资源。方法 分离人脐静脉内皮细胞,原代培养。感染含有SV40大T、小T抗原的慢病毒,连续传代培养。对感染后的HUVEC,RT-PCR检测大T的表达,免疫细胞化学检测vWF、CD31、CD34的表达及结合凝集素能力,透射电镜观察内皮细胞的超微结构,Matrigel检测管状成型,进行染色体核型分析,皮下接种BABL/c-nu裸鼠检测致瘤性,PCR法进行种属鉴定及支原体检测,短串联重复序列（STR）检测鉴定细胞身份。结果 转化后的人脐静脉内皮细胞命名为PUMC-HUVEC-T1,扁平多角状,汇合时典型铺路石排列,体外传代40代以上（1∶3～4）;细胞中有SV40LT mRNA的表达;vWF、CD31、CD34表达均阳性,可结合荆豆凝集素-1（UEA-1）;电镜可见WP小体;不同代数细胞核型正常稳定,裸鼠体内接种不成瘤。PUMC-HUVEC-T1种属鉴定为人源性,STR结果与原代HUVEC一致,无支原体的污染,国家实验细胞资源共享平台收藏。结论 建立了易获得、背景清楚、质量可靠的SV40 T抗原转化的HUVEC细胞系PUMC-HUVEC-T1。     

可利用小鼠诱导多能干细胞的建立及鉴定

目的 建立小鼠诱导多能性干细胞(iPSCs)模型,为干细胞和iPSCs研究提供可利用资源。 方法 取C57BL/6J小鼠12.5d的胚胎成纤维细胞,感染含有Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc的慢病毒进行重编程。病毒感染后12d挑取iPSCs的克隆进行扩大培养,进行碱性磷酸酶染色鉴定。体外悬滴培养检测拟胚体（EB）的形成,并皮下接种BABL/c裸鼠检测畸胎瘤形成。全反式维甲酸诱导iPSCs克隆株定向分化。PCR法进行种属鉴定并检测支原体。 结果 得到了12个碱性磷酸酶阳性的小鼠iPSCs克隆株,体外可以形成拟胚体,其中9个克隆株可以在BALB/c裸鼠体内形成畸胎瘤。全反式维甲酸可诱导iPSCs定向分化为平滑肌细胞。iPSCs克隆株种属鉴定为鼠源性,无支原体的污染,细胞资源中心入库保藏。结论 成功建立了小鼠iPSCs模型,为干细胞、iPSCs重编程机制及定向分化研究提供可利用的资源。     

超声造影评价小鼠三阴性乳腺癌模型特征及EGFR靶向治疗效果

目的 以超声造影（CEUS）动态观察小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）病灶及新生血管变化,评价表皮生长因子受体（EGFR）通路靶向治疗TNBC的价值。方法 建立30只TNBC小鼠模型,分为靶向组（靶向阻断EGFR通路）及对照组各15只。分别于建模后第5、10、15、20天行常规超声及CEUS检查,测量相关参数;每次检查结束后随机处死3~4只小鼠,以免疫组织化学检测肿瘤标本中EGFR及血管内皮生长因子（VEGF）表达。采用Spearman相关性分析评价CEUS参数与EGFR及VEGF的关系。结果 建模后第5天,靶向组与对照组肿瘤体积无明显差异（P>0.05）;建模后第10~20天,靶向组肿瘤体积均明显小于对照组（P均<0.05）。各时间点靶向组峰值强度（PI）均显著低于对照组（P均<0.05）;组间上升时间（RT）及峰值时间（TTP）差异均无统计学意义（P均>0.05）。建模后第10~20天靶向组EGFR均显著低于对照组（P均<0.05）;建模后第5~20天靶向组VEGF均显著低于对照组（P均<0.05）。EGFR与VEGF相关（r=0.629,P<0.001）;PI与EGFR及VEGF均相关（r=0.679、0.839,P均<0.001）。结论 CEUS可评估小鼠TNBC病灶及新生血管变化;靶向阻断EGFR通路可有效缩小小鼠TNBC模型肿瘤体积,降低其CEUS PI及EGFR、VEGF表达水平。     

小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立及生物学特性研究

目的:建立小鼠宫颈癌肿瘤细胞系,观察其生物学特性。方法:采用肿瘤原代培养法对小鼠U14肿瘤进行体外传代培养,定期对培养细胞进行形态学观察,进行免疫组织化学鉴定、细胞周期检查、染色体检测、细胞生长测定,进行615、C57BL/c小鼠移植观察体内成瘤情况,并用pEGFP-N1质粒转染U14细胞。结果:细胞呈贴壁和悬浮混合生长,CK阳性特征。体外连续培养10个月,传代50代,细胞倍增时间为21.83小时,细胞周期测定G1期为34%,G2期为26.4%,S期为39.6%。培养U14细胞3-4天处于对数生长期,染色体为亚四倍体核型,众数为64～84条。615小鼠、C57BL/c小鼠移植成瘤率均为100%,无支原体污染。建立了GFP( )的U14-GFP单克隆细胞株。结论:成功建立了小鼠U14子宫颈癌细胞系及GFP标记的U14-GFP细胞株,体内移植可建立常规及带荧光标记的肿瘤模型,可用于体内体外相结合的肿瘤研究。     

国内建立的人肿瘤细胞系的身份认证问题及对策

目的 为国内建立的人肿瘤细胞系进行身份认证，确认这些细胞系使用的可靠性。 方法 收集、整理国内实验室建立的人肿瘤来源细胞系，提取细胞的基因组DNA，PCR扩增其中的多个短串联重复序列（STRs）位点后进行毛细管电泳，分析获得细胞的STR图谱作为细胞系的DNA指纹，然后与原始组织或国际数据库中已有细胞的STR谱进行比对，通过匹配度的高低判断该细胞是否被其他细胞交叉污染。对怀疑HeLa细胞污染的肿瘤细胞，检测其基因组中是否有人乳头瘤病毒18型（HPV-18）病毒插入片段。对怀疑T细胞白血病细胞污染的，则检测T细胞的各种特性（表面标志），根据表面标志表达情况判断是否为错误细胞。 结果 本研究共收集了37种国内建立的肿瘤细胞系46个样品。本中心建立的6株细胞系均STR正确。其他单位建立的细胞系中有8株系正确，有23（62.2%）株系认定为错误细胞，人宫颈癌细胞HeLa是主要污染源；另外发现有些国内自建的细胞系被人结直肠癌细胞HCT-8、宫颈鳞癌细胞SiHa、T细胞白血病细胞CCRF-CEM及大鼠细胞污染。 结论 国内建立的肿瘤细胞很高比例地发生了细胞间的交叉污染，科研人员在实验前一定要首先进行细胞身份认定，或者从国家实验细胞资源共享服务平台选择细胞。另外，建立细胞系时保留原始组织用于后续细胞系的身份认证。     

乳腺癌组织细胞的高效原代培养及其特性

目的 高效扩增乳腺癌组织细胞,明确其特性,为乳腺癌深入研究及个体化治疗提供实验材料。方法 利用小鼠胚胎成纤维细胞3T3swiss作饲养层细胞,培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632,对乳腺癌组织细胞进行原代培养。CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;免疫细胞化学检测细胞CK分子表达;RT-PCR检测HER-2,ER,PR及乳腺癌干细胞相关标志分子(如CD44,CD24等)mRNA的表达;STR检测以明确细胞身份。结果 在饲养层细胞和Y-27632抑制剂同时存在的情况下,所培养的乳腺癌组织细胞增殖速度较快,可短时间获得大量细胞;细胞呈多角形上皮样,CK、HER-2、ER表达阳性,PR不表达;CD44和CD24表达阳性;经STR分析证明其身份正确。结论 饲养层细胞及ROCK抑制剂有助于乳腺癌组织细胞的原代培养及大量扩增,扩增的细胞性质稳定,可用于个体化治疗研究。     

四平社K260例脑卒中患者发病因素分析

目的了解社区脑卒中发病情况，为开展防治工作提供科学依据。方法对上海市杨浦区四平社区2004年4月--2005年9月期间发病的260例脑卒中患者人户凋查和病史回顾分析。结果脑卒中的发生与年龄、性别、诸多诱因及发病先兆等有关。结论开展并普及脑卒中健康教育，采取分级预防，控制发病是社区卫生服务中心的重要工作。