两株盖塔病毒全基因组序列测定与分子遗传进化

目的 对2011年和2017年分别在我国甘肃省和海南省分离的两株盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）进行全基因组核苷酸序列测定,分析其与我国1964年首次分离的盖塔病毒（M1）的分子差异及分子遗传进化特征。方法 使用病毒基因扩增技术测定新分离的两株盖塔病毒全基因组核苷酸序列,建立盖塔病毒基因组数据集并使用生物信息学软件进行病毒分子特征及分子遗传进化分析等。结果 两株新分离盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）基因组全长分别为11 690 nt和11 621 nt。两株病毒均具有甲病毒基因组结构特征。虽然两株病毒的结构基因、非结构基因以及非编码的连接区核苷酸序列长度均完全相同,但是病毒基因组5’和3’非编码区的核苷酸序列长度存在差异。两病毒株基因组3’UTR重复序列单元的结构未发生变化。病毒基因组同源性分析结果显示,海南省2017年分离的盖塔病毒（HNDZ1712-1）与我国于1964年首次在海南省蚊虫分离的盖塔病毒（M1）之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为97.7%和98.1%。盖塔病毒全基因组核苷酸序列的分子遗传进化分析结果显示,本研究的两株病毒及其所属病毒株...     

云南省新分离蚊浓核病毒的分子特征研究

对云南省新分离的14株浓核病毒进行基因序列测定和分析,以了解浓核病毒基因组结构及特性.用浓核病毒基因组扩增引物(DNV3F,DNV3R),RT-PCR扩增片段,PCR产物直接测序,拼接后获得基因序列.通过Clustal X(1.8)、DNAStar、GeneDoc (3.2) 等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析...     

辽宁省部分地区2006年虫媒病毒分离鉴定

目的 调查辽宁省虫媒病毒的种类及分布.方法 2006年8月在辽宁省沈阳市、营口市、盘锦市、锦州市和丹东市采集蚊虫标本,利用组织细胞培养分离病毒,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果 5个市共采集蚊虫标本5410只,分离到8株阳性分离物,经鉴定其中3株(LN0684、LN0688、LN0689)为版纳病毒,1株(LN0636)为甲病毒属盖塔病毒,另外4株尚在鉴定.新分离的版纳病毒与我国此前的分离株处于同一个进化簇,核苷酸同源性91.2%～94.7%.新分离的盖塔病毒与韩国分离株(swine)在一个进化枝上,核苷酸同源性为99.2%,与俄罗斯分离株、中国大陆分离株及台湾分离株的核苷酸同源性在95%～99%之间.结论 2006年在辽宁省分离到3株版纳病毒、1株盖塔病毒和4株未知虫媒病毒.版纳病毒、盖塔病毒为辽宁省首次分离;盖塔病毒核苷酸同源性和韩国分离株最近.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

从滇西北地区首次分离到版纳病毒

目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的最大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.     

浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析

目的 为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料,研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度,为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据.方法 设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因,PER产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定.通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 新分离乙脑病毒XJ69和NJP613株全基因组全长均为10 964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸.与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.5%～99.2%,氨基酸总体同源性为97.5%～99.7%.通过PrM/C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型,与上海三带喙库蚊分离株SH17M-07关系最为接近.     

2008年甘肃省新分离乙脑病毒的分子生物学特征

目的 对2008年甘肃省新分离乙脑病毒的PrM和E基因区段进行序列测定和分析,明确新分离病毒的基因型别并对E基因序列的分子特征进行分析.方法 对新分离乙脑病毒的PrM和E基因区段进行PCR扩增并测定序列.使用ClustalX2.09、MegAlign和Mega4软件对核苷酸和氨基酸序列进行分析并绘制系统发生树.结果 系统进化分析结果显示6株病毒均为基因Ⅰ型乙脑病毒,并且与2001和2002年越南分离株、2004年日本分离株及2004年我国四川省分离株进化关系较近.新分离株与减毒活疫苗株SA14-14-2相比,E基因核苷酸同源性为87.5%～87.9%,氨基酸同源性为96.8%～97.2%.新分离株与疫苗株在E基因区段存在11处共同位点的氨基酸差异.结论 2008年甘肃省分离的乙脑病毒均为基因Ⅰ型乙脑病毒,新分离株E基因氨基酸序列与疫苗株相比有部分差异,但均不属于决定抗原性的关键位点.     

蚯蚓纤溶酶PI_(239)基因在杆状病毒中的表达

利用基因重组技术将PI2 39基因通过细菌 /杆状病毒 (Bac to Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体 ,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 ,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞 ,细胞出现明显病变。SDS PAGE电泳可以见到相对分子质量 3 .0万位置有蛋白表达 ,免疫印记结果表明该条带可以与PI2 39抗体反应。提示蚯蚓纤溶酶PI2 39重组蛋白已经获得表达 ,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI2 39基因的生物学活性奠定了基础     

河南省新安县和息县2012年蚊传虫媒病毒调查

目的了解河南省部分地区蚊传虫媒病毒的种类分布及基因型别。方法于2012年5-8月在河南省洛阳市新安县和信阳市息县的居民住房、猪圈、牛棚及树林中采集蚊虫。使用细胞培养法分离病毒,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行种属特异扩增鉴定,并用Clustal X2.1、Meg Align、Genedoc 3.2和Mega v5.1生物信息学软件完成病毒核酸序列的分子生物学分析并进行基因分型。结果共采集蚊虫4属5种7149只,其中新安县以骚扰阿蚊居多(2055只,51.36%),息县以淡色库蚊(2964只,94.16%)为主。共分离获得5株病毒,直接接种BHK-21细胞无病变、C6/36细胞培养仅导致轻微病变,其C6/36细胞传代培养物转接BHK-21细胞后3 d可致细胞明显病变;序列分析表明这5株病毒均属基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV),其中3株分离自淡色库蚊,2株来自三带喙库蚊。结论河南省部分地区依然存在JEV及其传播媒介,且目前当地自然界中循环的JEV仍以基因Ⅰ型为主。     

塔希纳病毒的重组酶介导扩增快速检测方法

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增(RT-RAA)方法建立塔希纳病毒(TAHV)检测方法。方法在TAHV S节段保守区设计引物和探针。用构建含检测目的基因片段的质粒和病毒细胞培养物对TAHV的RT-RAA检测方法的灵敏性进行评价,通过检测黄病毒属、甲病毒属、正布尼亚病毒属和东南亚十二节段病毒属共7种病毒验证方法的特异性。并选用2018年采集自宁夏回族自治区的30批次蚊虫样本来评价该检测方法。结果该方法对构建的质粒标准品的检测下线为100拷贝/反应,病毒培养物最低检出限为10空斑形成单位/反应,与其他7种虫媒病毒无交叉反应。在检测蚊虫样本时,该方法与实时定量PCR方法检测结果的一致性为100%。结论建立了快速、特异以及灵敏的TAHV的RT-RAA检测方法,并适用于标本中TAHV核酸的现场检测。