盖塔病毒TaqMan RT-qPCR检测方法的建立与评价

目的:建立一种灵敏且特异的实时荧光定量RT-PCR方法,用于快速检测盖塔病毒(getah virus, GETV)。方法:从GenBank数据库下载GETV基因序列,使用Clustal X完成序列比对,针对高保守区段设计特异性引物和探针;以GETV核酸为标准品建立标准曲线,分别对检测反应的灵敏度、特异性和稳定性进行评价...     

云南省文山中越边境地区虫媒病毒调查

目的 对云南省文山县、河口县等中越边境地区开展虫媒病毒调查,以期了解当地蚊虫携带虫媒病毒情况.方法 2007年9月在当地5个采集点共采集蚊虫8326只,包括库蚊6091只,中华按蚊1334只,刺扰伊蚊848只,阿蚊53只,并保存于液氮.经消毒、研磨、离心等处理后进行组织培养细胞接种,分离病毒和对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定,以软件进行病毒的核苷酸序列比对和系统发生分析.结果 从库蚊分离到4株对C6/36细胞致病变的病毒分离物,其他蚊种没有分离到病毒分离物.鉴定结果表明,标本WS0704-2与版纳病毒抗体反应,PCR鉴定为版纳病毒,该病毒基因组第12片段的进化关系同中国其他版纳病毒有明显差异,位于一条独立的进化枝中,在进化上相对独立.标本WS0704-1、WS0708-1、WS0708-2为浓核病毒.结论 云南省文山中越边境地区存在多种蚊虫媒介并携带版纳病毒等虫媒病毒.     

辽宁省部分地区2006年虫媒病毒分离鉴定

目的 调查辽宁省虫媒病毒的种类及分布.方法 2006年8月在辽宁省沈阳市、营口市、盘锦市、锦州市和丹东市采集蚊虫标本,利用组织细胞培养分离病毒,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果 5个市共采集蚊虫标本5410只,分离到8株阳性分离物,经鉴定其中3株(LN0684、LN0688、LN0689)为版纳病毒,1株(LN0636)为甲病毒属盖塔病毒,另外4株尚在鉴定.新分离的版纳病毒与我国此前的分离株处于同一个进化簇,核苷酸同源性91.2%～94.7%.新分离的盖塔病毒与韩国分离株(swine)在一个进化枝上,核苷酸同源性为99.2%,与俄罗斯分离株、中国大陆分离株及台湾分离株的核苷酸同源性在95%～99%之间.结论 2006年在辽宁省分离到3株版纳病毒、1株盖塔病毒和4株未知虫媒病毒.版纳病毒、盖塔病毒为辽宁省首次分离;盖塔病毒核苷酸同源性和韩国分离株最近.     

新疆库蚊分离的0507JS11病毒为Brevidensovirus新成员

目的 揭示新疆库蚊分离的0507JS11病毒的基本特征,明确其分类地位.方法 对0507JS11病毒进行细胞感染特点观察、负染电子显微镜(简称电镜)观察、基因组核酸电泳检测、全基因序列测定和系统进化分析.结果 0507JS11病毒可以引起Aedes albopictus C6/36细胞病变;完整病毒颗粒呈20面立体对称,直径20 nm,无包膜;病毒基因组为长3977 nt的单股正链DNA,基因组核酸电泳检测呈大小约4 kbp的DNA条带;病毒基因组编码区包括3个开放读码框(open readingframe,ORF),ORF1和ORF2编码非结构蛋白(non-structural protein,NS),ORF3编码衣壳蛋白(capsidprotein,VP);全基因序列系统进化分析显示病毒位于Brevidensovirus内一个独立进化分支.结论 新疆库蚊分离的0507JS11病毒为Brevidensovirus新成员.     

E基因在辛德毕斯病毒与辛德毕斯样病毒细胞感染特性中的作用

目的 寻找辛德毕斯病毒(YN87448病毒)与辛德毕斯样病毒(XJ-160病毒)对细胞感染特性差异的分子基础.方法 生物信息学比较两种病毒糖蛋白基因一级结构及二级结构,分析二者之间的差异,并利用病毒基因重组等现代分子生物学技术构建重组病毒来研究糖蛋白基因在病毒感染细胞特性中的贡献.结果 生物信息学分析显示,YN87448病毒和XJ-160病毒基因组分别具有11 717和11 626核苷酸序列,具有相同的基因组结构特征;两种病毒E基因氨基酸的疏水性主峰基本相同但存在82个散在分布的氨基酸差异位点.病毒基因重组研究结果显示,将XJ-160病毒E基因替换为YN87448病毒E基因的重组病毒(XJ-160/YE1E2)无论在致细胞病变时间,空斑形成直径,还是在病毒功能蛋白的表达等方面均完全体现YN87448病毒特征,而与XJ-160病毒野毒株的表现完全不同.结论 E基因在辛德毕斯病毒与辛德毕斯样病毒细胞感染特性差异方面起着重要作用,这一结果为从分子生物学角度解释两病毒间生物学差异提供了分子生物学理论依据.     

河南省新安县和息县2012年蚊传虫媒病毒调查

目的了解河南省部分地区蚊传虫媒病毒的种类分布及基因型别。方法于2012年5-8月在河南省洛阳市新安县和信阳市息县的居民住房、猪圈、牛棚及树林中采集蚊虫。使用细胞培养法分离病毒,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行种属特异扩增鉴定,并用Clustal X2.1、Meg Align、Genedoc 3.2和Mega v5.1生物信息学软件完成病毒核酸序列的分子生物学分析并进行基因分型。结果共采集蚊虫4属5种7149只,其中新安县以骚扰阿蚊居多(2055只,51.36%),息县以淡色库蚊(2964只,94.16%)为主。共分离获得5株病毒,直接接种BHK-21细胞无病变、C6/36细胞培养仅导致轻微病变,其C6/36细胞传代培养物转接BHK-21细胞后3 d可致细胞明显病变;序列分析表明这5株病毒均属基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV),其中3株分离自淡色库蚊,2株来自三带喙库蚊。结论河南省部分地区依然存在JEV及其传播媒介,且目前当地自然界中循环的JEV仍以基因Ⅰ型为主。     

2013年青海省德令哈地区蚊虫及蚊媒病毒调查

目的 调查青海省海西州德令哈地区蚊虫及蚊媒病毒的种类及分布。方法 在德令哈地区采集蚊虫标本, 蚊虫标本经实验室常规处理后使用C6/36、BHK-21和Vero细胞开展病毒分离及9种病毒特异性基因检测及分析。结果 2013年在德令哈地区共采集蚊虫6050只, 分别为黄背伊蚊和里海伊蚊, 其构成比分别为92.6%(5600/6050)和7.4%(450/6050)。所有蚊虫标本分为96批, 接种上述3种细胞, 这些蚊虫标本在BHK-21和Vero细胞上均未出现病变也未检测病毒基因阳性。但有32批蚊虫标本接种的C6/36细胞上清液和对应蚊虫标本研磨液中均检测到辽宁病毒(liaoningvirus, LNV), 其中黄背伊蚊27批, 里海伊蚊5批。病毒基因进化分析发现德令哈市分离的LNV与我国在新疆分离的LNV处在同一进化分支。结论 2013年青海省德令哈地区黄背伊蚊为优势蚊种, 黄背伊蚊和里海伊蚊标本中LNV感染率均较高, 为首次在当地发现LNV。     

塔希纳病毒的重组酶介导扩增快速检测方法

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增(RT-RAA)方法建立塔希纳病毒(TAHV)检测方法。方法在TAHV S节段保守区设计引物和探针。用构建含检测目的基因片段的质粒和病毒细胞培养物对TAHV的RT-RAA检测方法的灵敏性进行评价,通过检测黄病毒属、甲病毒属、正布尼亚病毒属和东南亚十二节段病毒属共7种病毒验证方法的特异性。并选用2018年采集自宁夏回族自治区的30批次蚊虫样本来评价该检测方法。结果该方法对构建的质粒标准品的检测下线为100拷贝/反应,病毒培养物最低检出限为10空斑形成单位/反应,与其他7种虫媒病毒无交叉反应。在检测蚊虫样本时,该方法与实时定量PCR方法检测结果的一致性为100%。结论建立了快速、特异以及灵敏的TAHV的RT-RAA检测方法,并适用于标本中TAHV核酸的现场检测。     

湖北省部分地区2009年蚊传虫媒病毒调查

目的调查湖北省部分地区蚊传虫媒病毒种类和分布状况。方法 2009年夏季在湖北省黄冈市武穴市和咸宁市通城县采集蚊虫标本,用组织培养法分离病毒,用血清学和分子生物学方法对阳性病毒分离物进行鉴定,利用生物信息学软件对新分离病毒进行序列同源性和系统进化分析。结果采集到3属5种9424只蚊虫标本,阳性4株(HBTC0913、HBTC0917、HBTC0919和HBTC0921),经血清学和分子生物学鉴定均为版纳病毒;版纳病毒第12节段分子进化分析显示,4株新分离版纳病毒与中国北京、云南和内蒙古地区以及越南的分离株处于同一亚群,而印度尼西亚分离株处于另外一个进化群中;新分离株与其他分离株相比,第12节段编码区核苷酸同源性为87.2%～89.8%,氨基酸同源性为86.1%～90.9%。结论在湖北省分离到版纳病毒,与中国云南毒株YN6的进化关系较近。     

蚯蚓纤溶酶PI_(239)基因在杆状病毒中的表达

利用基因重组技术将PI2 39基因通过细菌 /杆状病毒 (Bac to Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体 ,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 ,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞 ,细胞出现明显病变。SDS PAGE电泳可以见到相对分子质量 3 .0万位置有蛋白表达 ,免疫印记结果表明该条带可以与PI2 39抗体反应。提示蚯蚓纤溶酶PI2 39重组蛋白已经获得表达 ,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI2 39基因的生物学活性奠定了基础