Banna病毒TaqMan探针法RT-PCR检测方法的建立

目的 建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法。方法 首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计。病毒在BHK21细胞或C6／36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录。以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测，并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价。结果 Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性，可以检出所有12株Banna病毒，而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、bated病毒和环状病毒检测结果均为阴性。与传统PCR相比，敏感性高100倍以上，可以检出每50止标本中含有0.5CCID50的Banna病毒。单链RNA变性条件（65℃）进行逆转录使检测结果的敏感性比99℃变性法最少低10倍。病毒在室温保存1天和4℃保存1周后，检出敏感性会比原来低10倍左右。该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时，均显示出较好的特异性。112份蚊标本中检出6份标本阳性，4份可疑阳性，病毒分离结果3份阳性。结论 本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法，并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测，为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段。     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

从滇西北地区首次分离到版纳病毒

目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的最大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.     

从辽宁省再次分离到基因1型乙型脑炎病毒

目的 了解2007年在辽宁省分离的乙型脑炎病毒基因型别及其病毒E基因分子特征.方法2006年8月在辽宁省东港市采集蚊虫标本,利用组织培养细胞进行病毒分离,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果从采集的30批,共1500只三带喙库蚊标本中分离到2株病毒,命名为LNDG07-02、LNDG07-16,经鉴定均为基因1型乙脑病毒.病毒E基因区段核苷酸和氨基酸序列与乙脑减毒活疫苗株(SA14-14-2株)的同源性分别为87.8%～88.0%和97.2%,新分离病毒E基因区段与疫苗株存在11处氨基酸位点差异,与2002年在辽宁省分离的乙脑病毒相比,未发现氨基酸位点变异.结论自2002年以来在东港市再次分离到基因1型乙脑病毒,与2002年在辽宁分离的基因1型乙脑病毒相比E基因区段氨基酸未发生变异.基因1型乙脑病毒在辽宁省东港市持续存在.     

乙型脑炎病毒TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用

目的 利用TaqMan PCR技术，建立乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）实时荧光PCR检测方法，初步应用于蚊虫媒介的JEV监测。方法根据GenBank发表的JEV全基因组序列资料分析结果，在其NS5基因区段设计JEV特异的引物与探针；优化Mg^2＋浓度和引物浓度比例，并利用11株JEV和7株相关病毒株考核检测体系的保守性、特异性、灵敏性和稳定性；利用体外转录的病毒RNA和定量的病毒样品，建立相应的定量分析模型；初步应用于蚊虫媒介的监测与检测分析。结果Mg^2＋优化浓度为5mmol／L，上下游引物浓度比例为4：1，引物探针具有良好的保守性和特异性，灵敏度为10PFU／ml，稳定性分析表明，同一样品Ct值的重复检测5次，变异系数均小于5％；绘制两种标准曲线，构建了JEV基因拷贝数、病毒滴度为分析指标的定量分析模型，检测蚊虫标本结果显示，TaqMan PCR方法较病毒分离法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的JEVTaqMan PCR检测方法，为蚊虫媒介检测奠定了基础，为乙型脑炎的预防控制和脑炎相关疾病的诊断与鉴别诊断提供了一种技术手段。     

从滇西北地区首次分离到版纳病毒

目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的最大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.     

从滇西北地区首次分离到版纳病毒

目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的最大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.     

从滇西北地区首次分离到版纳病毒

目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的最大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.     

乙型脑炎病毒单克隆抗体制备及其特性鉴定

目的制备乙脑病毒单克隆抗体并对其各项生物学性质进行鉴定。方法通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备乙脑单抗,使用ELISA、IFA、中和试验和Westernblot等方法鉴定单抗的敏感性、特异性、种内反应广谱性以及中和活性。结果最终获得3株稳定分泌的乙脑单克隆抗体细胞株,其滴度均超过106。3株单抗只与乙脑病毒反应,与其他9种虫媒病毒皆不反应。ELISA相加试验证明3株单抗的作用位点非常相近,选择其中的F12.37与10个代表性乙脑病毒株反应,F12.37能够敏感地检测到所有10个在细胞内复制的病毒株。F12.37还能够中和乙脑P3株(基因Ⅲ型)和SH03-103株(基因Ⅰ型),保护50%细胞不产生病变的稀释度分别为1∶3.2×105和1∶105,Westernblot结果显示F12.37与乙脑病毒E蛋白相互作用。结论本研究获得了3个高滴度、高特异性的乙脑单克隆细胞株,其中F12.37具有较高的敏感性和较好的种内反应广谱性,能够中和两个基因型乙脑病毒,其作用位点位于乙脑病毒E蛋白。     

我国首次分离巴泰病毒的分子生物学鉴定

目的对从云南蚊虫中分离的YN924病毒进行分子生物学鉴定,从分子生物学水平明确其分类地位。方法扩增YN924病毒的S片段并测序,通过ClustalX(1.8)、Phylip、Treeview(3.2)软件对S片段的序列进行分析,并构建种系发生树;对S片段编码产物N蛋白及NSs蛋白的氨基酸顺序进行分析。结果用两对引物均可从YN924病毒扩增出产物,序列分析发现S片段与巴泰病毒(X73464)的同源性最高,为96.4%;N蛋白、NSs蛋白的氨基酸顺序与巴泰病毒的同源性分别为99.1%和98%。结论从云南分离的YN924病毒属于巴泰病毒,我国首次对该病毒进行分子生物学鉴定。