云南省文山中越边境地区虫媒病毒调查

目的 对云南省文山县、河口县等中越边境地区开展虫媒病毒调查,以期了解当地蚊虫携带虫媒病毒情况.方法 2007年9月在当地5个采集点共采集蚊虫8326只,包括库蚊6091只,中华按蚊1334只,刺扰伊蚊848只,阿蚊53只,并保存于液氮.经消毒、研磨、离心等处理后进行组织培养细胞接种,分离病毒和对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定,以软件进行病毒的核苷酸序列比对和系统发生分析.结果 从库蚊分离到4株对C6/36细胞致病变的病毒分离物,其他蚊种没有分离到病毒分离物.鉴定结果表明,标本WS0704-2与版纳病毒抗体反应,PCR鉴定为版纳病毒,该病毒基因组第12片段的进化关系同中国其他版纳病毒有明显差异,位于一条独立的进化枝中,在进化上相对独立.标本WS0704-1、WS0708-1、WS0708-2为浓核病毒.结论 云南省文山中越边境地区存在多种蚊虫媒介并携带版纳病毒等虫媒病毒.     

新疆库蚊分离的0507JS11病毒为Brevidensovirus新成员

目的 揭示新疆库蚊分离的0507JS11病毒的基本特征,明确其分类地位.方法 对0507JS11病毒进行细胞感染特点观察、负染电子显微镜(简称电镜)观察、基因组核酸电泳检测、全基因序列测定和系统进化分析.结果 0507JS11病毒可以引起Aedes albopictus C6/36细胞病变;完整病毒颗粒呈20面立体对称,直径20 nm,无包膜;病毒基因组为长3977 nt的单股正链DNA,基因组核酸电泳检测呈大小约4 kbp的DNA条带;病毒基因组编码区包括3个开放读码框(open readingframe,ORF),ORF1和ORF2编码非结构蛋白(non-structural protein,NS),ORF3编码衣壳蛋白(capsidprotein,VP);全基因序列系统进化分析显示病毒位于Brevidensovirus内一个独立进化分支.结论 新疆库蚊分离的0507JS11病毒为Brevidensovirus新成员.     

湖北省部分地区2009年蚊传虫媒病毒调查

目的调查湖北省部分地区蚊传虫媒病毒种类和分布状况。方法 2009年夏季在湖北省黄冈市武穴市和咸宁市通城县采集蚊虫标本,用组织培养法分离病毒,用血清学和分子生物学方法对阳性病毒分离物进行鉴定,利用生物信息学软件对新分离病毒进行序列同源性和系统进化分析。结果采集到3属5种9424只蚊虫标本,阳性4株(HBTC0913、HBTC0917、HBTC0919和HBTC0921),经血清学和分子生物学鉴定均为版纳病毒;版纳病毒第12节段分子进化分析显示,4株新分离版纳病毒与中国北京、云南和内蒙古地区以及越南的分离株处于同一亚群,而印度尼西亚分离株处于另外一个进化群中;新分离株与其他分离株相比,第12节段编码区核苷酸同源性为87.2%～89.8%,氨基酸同源性为86.1%～90.9%。结论在湖北省分离到版纳病毒,与中国云南毒株YN6的进化关系较近。     

湖北省新分离的二株乙型脑炎病毒全基因组序列特征分析

目的 对2008年湖北省新分离的2株乙型脑炎(简称乙脑)病毒进行全基因组序列测定和分析,了解当地乙脑病毒株的分子生物学特性.方法 病毒复苏鉴定后,使用覆盖乙脑病毒全基因组的16对特异性引物,RT-PCR法扩增乙脑病毒HBZG08-09株和HBZG08-55株的全基因组片段,直接测序拼接获得全基因组序列.使用ClustalX 1.83、MegAlign、Mega 4和Genedoc 3.2等生物学软件进行序列比对、核苷酸和氨基酸同源性分析、系统进化分析及氨基酸位点差异分析.结果 新分离的2株乙脑病毒基因组全长均为10 965个核苷酸,从97位到10 392位为开放阅读框,编码3432个氨基酸,2株间的全基因组核苷酸和氨摹酸间源性分别是98.2%和99.7%.进一步的基因型研究显示HBZG08-09株和HBZG08-55株均属于基因Ⅰ型乙脑病毒.2株病毒与我国近年来在河南及浙江的乙脑病毒分离株进化关系最近.与目前使用的减毒活疫苗株SA-14-14-2相比较,HBZG08-09株全基因组共存在82个氨基酸差异,HBZG08-55株存在84个氨基酸差异.但影响毒力或抗原的关键氨基酸位点未发生改变.结论 新分离的2株乙脑病毒均属于基因Ⅰ型,与疫苗株相比关键氨基酸位点未见变异.     

贵州省不同地区2008年虫媒病毒调查

目的调查贵州省不同地区虫媒病毒分布状况,对采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2008年7月在贵州省黔西、德江、榕江和从江县的4个标本采集点使用诱蚊灯采集蚊虫标本,通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定;利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析。结果采集到3属4种共计9160只蚊虫标本,从中分离到9株病毒,鉴定结果显示8株为盖塔病毒,1株为流行性乙型脑炎病毒(JEV);贵州省新分离盖塔病毒与原型株相比,核苷酸同源性为94.5%～94.9%,氨基酸同源性为97.4%～97.6%;新分离JEV与基因Ⅰ型JEV的同源性最高,系统进化分析结果显示属于基因Ⅰ型JEV。结论在贵州省分离到盖塔病毒和基因Ⅰ型JEV。盖塔病毒新分离株与我国其他省份分离株进化关系较近;JEV新分离株与四川省分离株进化关系较近。     

辽宁省部分地区2008年虫媒病毒分离鉴定

目的在辽宁省采集蚊虫标本进行病毒分离,了解虫媒病毒分布情况。方法2008年夏季在辽宁省丹东和锦州市采集蚊虫标本,利用C6/36和BHK-21等细胞分离病毒;对新分离病毒利用血清学、分子生物学和生物信息学方法进行鉴定。结果在辽宁省丹东和锦州市共采集蚊虫标本3属5种9296只,包括库蚊属的三带喙库蚊、淡色库蚊,伊蚊属的刺扰伊蚊、背点伊蚊和按蚊属的中华按蚊。从蚊虫标本中共得到4株病毒分离物,其中1株为乙型脑炎(乙脑)病毒(丹东市的三带喙库蚊),2株为版纳病毒(锦州市的中华按蚊),1株为辽宁病毒和版纳病毒混合(锦州市的中华按蚊)。新分离乙脑病毒属于基因Ⅰ型乙脑病毒,E基因编码病毒毒力和抗原表位的位点未发生改变。结论在辽宁省再次分离到乙脑病毒,并首次证明辽宁省存在辽宁病毒。     

Koutango病毒TaqMan反转录聚合酶链式反应方法的建立

目的建立Koutango病毒(KOUTV)的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载KOUTV基因序列,进行多序列比对分析,针对NS5基因中的高保守序列片段设计KOUTV的特异引物与探针,用4科9种病毒进行检测方法特异性验证,通过平行重复实验验证检测方法稳定性,利用体外转录的RNA标准品建立了KOUTV的NS5基因拷贝数的绝对定量分析模型。结果引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测循环阈值(Ct)的变异系数均小于1.5%,定量分析模型灵敏度达到1.0×10^2拷贝/反应。通过本研究建立的快速检测方法对新疆采集的112批,6328只蚊虫进行了测定,结果均为阴性。结论成功建立了KOUTV的高特异性、高敏感性的TaqMan RT-PCR检测方法,可应用于实验室和临床诊断。     

海南省2017-2018年虫媒病毒的分离与鉴定

目的了解海南省虫媒病毒种类及分布变化。方法于2017-2018年在海南省野外采集吸血昆虫标本,所有吸血昆虫标本实验室处理后用BHK-21细胞和C6/36细胞进行病毒分离,同时使用RT-PCR平行检测吸血昆虫标本中虫媒病毒基因。结果共采集到4属(库蚊、阿蚊、伊蚊、按蚊)15062只蚊虫和11360只蠓虫。采集的蚊虫中三带喙库蚊居多,占蚊虫采集总数92.88%(13990/15062)。经组织培养细胞共获得4株病毒分离物,其中3株乙型脑炎(乙脑)病毒、1株盖塔病毒,在5批三带喙库蚊标本中检测到乙脑病毒基因阳性。遗传进化分析结果显示这3株乙脑病毒和5批PCR筛检阳性的标本均属于基因1型乙脑病毒。当地乙脑病毒的最低感染率为0.57‰(8/13990)。在5批蠓虫标本中检测阿卡斑病毒基因阳性,当地阿卡斑病毒的最低感染率为0.44‰(5/11360)。基于病毒S基因和M基因序列的系统进化分析显示这5株阿卡斑病毒处于单独进化分支形成独特的地理分布特征。结论继1980年代以来,从海南省的蚊虫标本中再次分离到乙脑病毒和盖塔病毒、蠓虫标本中检测到阿卡斑病毒。应加强乙脑病毒、盖塔病毒和阿卡斑病毒对人畜动物感染状况及疾病负担的监测,以减少对当地公共卫生健康的危害。     

Kadipiro病毒TaqmanReal—timePCR检测方法的建立

目的利用TaqManReal—timePCR技术，建立Kadipiro病毒（KDV）实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank发表的KDV基因序列资料分析结果，在其第12片段基因区段设计KDV特异引物与探针，利用14株不同科属病毒核酸验证方法特异性，重复实验检验方法稳定性，利用体外转录的定量RNA标准品建立基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针具有良好的特异性，同一样品重复检测D值的变异系数均〈1．8％，定量分析模型的灵敏度为100拷贝／反应。结论建立了一种特异、灵敏、高效的KDV一步法TaqManReal-timePCR检测方法，为今后该病毒的监测与研究工作提供技术手段。