2006年河南省南阳市流行性乙型脑炎病毒的分离与分子特征分析

目的在河南省南阳市采集蚊虫标本,进行西尼罗病毒基因检测,分离流行性乙型脑炎(乙脑)病毒并分析分离株的分子生物学特征。方法 2006年从南阳市采集蚊虫标本,将标本研磨处理后进行巢式PCR检测西尼罗病毒核酸,用细胞培养法对标本进行病毒分离,通过血清学与分子生物学方法鉴定新分离到的乙脑病毒,扩增分离株PrM和E基因区,使用生物学软件进行序列和系统发生分析。结果共采集蚊虫标本6231只,巢式PCR检测西尼罗病毒结果均为阴性。从标本中分离到7株病毒,经鉴定均为乙脑病毒。基因分型显示7株病毒均为基因Ⅰ型,新分离株在E基因之间的核苷酸同源性为98.5%～100%,氨基酸同源性为98.4%～100%。新分离株与P3株和SA14-14-2的E基因核苷酸同源性分别为87.7%～88.2%和87.3%～87.9%。新分离株与P3株相比存在10个共同氨基酸差异位点,但在决定毒力的关键位点不同于SA14-14-2。结论河南省南阳市2006年乙脑病毒流行株为基因Ⅰ型,毒株的毒力基因没有明显改变,所有标本均未检测到西尼罗病毒阳性。     

塔希纳病毒的重组酶介导扩增快速检测方法

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增(RT-RAA)方法建立塔希纳病毒(TAHV)检测方法。方法在TAHV S节段保守区设计引物和探针。用构建含检测目的基因片段的质粒和病毒细胞培养物对TAHV的RT-RAA检测方法的灵敏性进行评价,通过检测黄病毒属、甲病毒属、正布尼亚病毒属和东南亚十二节段病毒属共7种病毒验证方法的特异性。并选用2018年采集自宁夏回族自治区的30批次蚊虫样本来评价该检测方法。结果该方法对构建的质粒标准品的检测下线为100拷贝/反应,病毒培养物最低检出限为10空斑形成单位/反应,与其他7种虫媒病毒无交叉反应。在检测蚊虫样本时,该方法与实时定量PCR方法检测结果的一致性为100%。结论建立了快速、特异以及灵敏的TAHV的RT-RAA检测方法,并适用于标本中TAHV核酸的现场检测。     

乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1基因的重组表达及其与黄病毒属病毒抗原抗体反应研究

目的阐明重组表达乙脑病毒非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)与包括乙脑病毒在内的多种蚊传黄病毒的抗原抗体反应,以及对乙脑病毒感染患者急性期血清标本的抗原抗体反应。方法本研究使用大肠杆菌原核表达载体(prokaryotic expression vector,pET)系统,重组表达乙脑病毒NS1基因。使用Western Blot实验方法检测重组表达蛋白质与多种,包括乙脑病毒在内的蚊传黄病毒抗体的反应,以及乙脑病毒感染患者急性期血清的抗原抗体反应。结果乙脑病毒(P3株)NS1基因表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性的表达产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE,简称变性胶)显示为单一条带,分子量约为45000。进一步的抗原抗体分析结果表明,表达产物与乙脑病毒(蚊虫分离株,脑炎患者分离株)多克隆或者单克隆抗体以及乙脑病毒感染病人急性期血清标本可以获得完全一致的抗原/抗体杂交反应。重组表达产物与蚊传黄病毒,如登革病毒和黄热病毒多克隆抗体之间抗原/抗体杂交反应为阴性,但与西尼罗病毒和墨累谷脑炎病毒多克隆抗体呈现抗原/抗体阳性杂交反应。结论本文成功获得乙脑病毒NS1蛋白的重组表达并分析了重组蛋白对多种蚊传黄病毒及乙脑病毒感染患者标本之间的抗原/抗体反应,研究结果对于阐明乙脑病毒NS1蛋白与蚊传黄病毒之间抗原抗体反应提供了重要的基础数据。本研究所获得重组表达蛋白为进一步研究乙脑病毒NS1蛋白质功能等提供了重要的物质基础。     

血管抑制素和内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

血管抑制素（AS）和内皮抑制素（ES）是两种具有较强活性的内源性血管抑制剂，联合应用具有协同作用。本研究通过大肠杆菌表达AS-ES融合蛋白，观察其对血管生成的抑制作用。首先用RT-PCR方法分别获得AS和ES基因，通过基因拼接获得融合基因，构建了含有该融合基因的原核表达质粒——pET-42（b）／AS-ES。表达菌株经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体形式表达，表达量为14％，分子量约65KD。Western blotting检测表明表达产物可分别与AS和ES抗体产生特异的免疫反应。经复性、肝素亲和层析柱纯化的表达产物对鸡胚尿囊膜血管有明显抑制作用。本研究获得了AS、ES在大肠杆菌中的融合表达．目的蛋白具有特异的免疫反应性和血管抑制活性。     

从滇西北地区首次分离到版纳病毒

目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的最大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.     

四川省流行性乙型脑炎病毒优势基因型的研究

目的了解四川省乙脑主要流行区乙脑病毒的分子生物学特性,为防治提供依据。方法对2007-2010年间分离到的13株乙脑病毒进行PreM和E基因区扩增,采用MEGA5生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果基因分型显示13株均属于基因I型。13株病毒之间比较,PreM基因核苷酸和氨基酸同源性为97％-100％和98．7％-100％,E基因核苷酸和氨基酸同源性为97．8％～99．9％和99．6％～100％,其同源性极高。13株病毒与2004年四川分离株比较E基因核苷酸同源性在97．7％～99．6％之间,氨基酸同源性在98．6％-100％之间;PreM基因的核苷酸同源性在96．2％-99．1％之间,氨基酸同源性在97．5％-98．7％之间;与疫苗株P3和SA14—14—2比较E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为87．6％～88．3％和97％～97．8％;PreM基因核苷酸和氨基酸同源性分别为84．1％～85．8％和93．7％-96．2％。13株病毒E基因的8个氨基酸毒力位点均没有发生改变。结论四川省乙脑病毒已呈现基因I型为优势型别的态势,其PreM和E区核苷酸和氨基酸高度保守,关键的氨基酸毒力位点没有变化,提示目前使用的疫苗对流行株的感染具有保护作用。     

我国部分地区病毒性脑炎标本的实验室检测

目的 初步了解我国病毒性脑炎的病原种类及其分布特征.方法用ELISA方法对2004年至2006年从我国6个省份收集的771例临床诊断为病毒性脑炎患者的急性期血清和脑脊液标本检测乙脑病毒IgM抗体,然后对乙脑IgM抗体阴性的所有血清标本检测其他7种常见病毒IgM抗体.此外,用PCR方法对54例脑脊液标本检测肠道病毒、版纳病毒和辽宁病毒的基因.结果经血清学检测,771例患者中的567例(73.5%)检测出病毒特异性IgM抗体,构成顺序为乙脑病毒(47.0%)、腮腺炎病毒(10.6%)、肠道病毒(8.8%)、单纯疱疹病毒(5.7%)、麻疹病毒(0.4%)、水痘-带状疱疹病毒(0.4%)、EB病毒(0.4%)、巨细胞病毒(0.3%);经分子生物学检测,在54例脑脊液中检测到8例(14.8%)肠道病毒基因阳性标本,未检测到版纳病毒与辽宁病毒基因阳性标本.结论乙脑病毒是我国病毒性脑炎的首要病原,腮腺炎病毒次之,肠道病毒和单纯疱疹病毒也是重要的病原.     

传播链和非传播链SARS患者中SARS冠状病毒抗体的分布及变化规律

目的　探讨人体对SARS CoV血清抗体反应及分布规律。方法　对 30 1例临床诊断病例的血清标本 (其中传播链上的病例 15 8例 ,非传播链病例 14 3例 ) ;采用北京华大GBI生物技术有限公司生产的间接ELISA试剂 ,进行SARS CoVIgG抗体的检测 ,部分病例还进行了SARS CoVIgM的检测。结果　传播链涉及 15条 ,最多涉及 4代 ,各条链的SARSIgG抗体阳性率为 85 70 %～ 10 0 .0 0 % ,总阳性率为 94 30 % (14 9 15 8)。SARS病例数随代数增加而减少。但各代间IgG阳性率的差异无显著意义 ;χ2 =5 11,P >0 0 5。非传播链病例的血清抗体阳性率为 12 5 9% (18 14 3)。与传播链的阳性率比较 ,两者间的差异有显著意义 ;χ2 =199 6 4 ,P <0 0 0 1。在发病后的 0～ 7d、8～ 14d、15～ 2 1d、2 2～ 30d内 ,SARS CoVIgG的累计阳性率分别为 16 6 7%、4 0 0 0 %、70 0 0 %、93 10 % ;然后进入平台期 ,并可以维持 6个月以上。在发病 7d内 ,SARS CoVIgM的累计阳性率为 16 6 7% ,8～ 14d时 ,已有 5 5 17%的标本IgM抗体阳转 ,在 2 1～ 30d时 ,抗体阳性率达高峰 (86 96 % ) ,以后迅速下降。结论　SARS感染后 ,94 %的感染者可产生IgG抗体。检测该抗体可以作为临床核实诊断的依据。SARS CoVIgG抗体在 7d时可能检出 ,一般在 4周达     

蚯蚓纤溶酶PI_(239)基因在杆状病毒中的表达

利用基因重组技术将PI2 39基因通过细菌 /杆状病毒 (Bac to Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体 ,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 ,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞 ,细胞出现明显病变。SDS PAGE电泳可以见到相对分子质量 3 .0万位置有蛋白表达 ,免疫印记结果表明该条带可以与PI2 39抗体反应。提示蚯蚓纤溶酶PI2 39重组蛋白已经获得表达 ,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI2 39基因的生物学活性奠定了基础