医学检验专业分子生物学实验教学实践与体会

分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科,现已广泛应用于医学检验中。笔者结合自己分子生物学实验教学经验,介绍了细胞与分子诊断系医学检验专业分子生物学实验教学改革现状,肯定了目前分子生物学实验教学改革的效果,同时对存在的问题进行深入分析,并提出相应的完善对策。     

人磷酸二酯酶同工酶3A在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人磷酸二酯酶同工酶3A(HPDE3A)在Tn细胞中的表达。方法用重组HPDE3A杆状病毒感染昆虫Tn细胞进行蛋白表达，通过RT-PCR，SDS-PAGE和Western blotting技术检测HPDE3A表达情况。结果重组杆状病毒在感染Tn细胞后形态变化明显，获得表达产物,RT-PCR扩增结果证实了Tn细胞中HPDE3A的mRNA水平增高，Tn细胞能够表达出与HPDE3A多克隆抗体结合的蛋白，蛋白分子质量约为120 kD。结论HPDE3A在昆虫杆状病毒表达系统中可以稳定表达，为进一步研究HPDE3A的生物学活性及筛选HPDE3A抑制剂奠定了基础。     

胶原诱导的关节炎小鼠脾脏单个核细胞TLR8的表达及其与相关细胞因子的关系

目的:观察Toll样受体8(TLR8)在鸡Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型小鼠脾脏单个核细胞中的表达及其与IL-10等细胞因子表达的关系.方法:12只DBA/1J小鼠随机分成造模组和阴性对照组.造模组小鼠采用鸡Ⅱ型胶原诱导,在诱导后的第27天出现关节红肿时处死所有小鼠.用ELISA测定小鼠外周血的TNF-α,HE染色观察小鼠关节的炎症变化,Real-time PCR检测脾脏单个核细胞表达IL-10、IL-17A、IL-1β及TLR8的水平.结果:HE染色结果显示,造模组小鼠关节部位与阴性对照组相比出现明显的炎症细胞浸润;造模组小鼠的外周血血清TNF-α水平较阴性对照组明显升高(P< 0.01);模型小鼠脾脏单个核细胞表达IL-10、IL-17A、TLR8和IL-1β的水平也明显高于阴性对照组(P<0.01或P<0.05).相关性分析表明,TLR8的表达与IL-10的表达呈负相关(r=0.945;P<0.01),而与IL-17A、IL-1β无明显相关性(P>0.05).结论:TLR8在鸡Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型小鼠脾脏单个核细胞中的表达水平明显升高.尽管IL-10的表达水平也高于对照组,但其与TLR8的表达呈现明显负相关.     

骨髓间充质干细胞下调类风湿性关节炎小鼠脾脏单个核细胞TLR8及TLR9的表达

背景：间充质干细胞能够缓解类风湿性关节炎小鼠的症状,但是其机制还不清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞对类风湿性关节炎小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8及TLR9等的影响。 方法：DBA/1J小鼠随机分3组,非造模组不造模,阳性对照组和实验组制备Ⅱ型胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎模型。实验组尾静脉注射移植大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：与阳性对照组比较,实验组小鼠关节直径明显减小,关节炎症细胞浸润程度明显降低,但比非造模组略高;小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8、TLR9和白细胞介素1β的水平较阳性对照组明显降低(P < 0.01或P < 0.05);阳性对照组与实验组中TLR8与TLR9的表达均无明显相关性(P > 0.05)。说明骨髓间充质干细胞下调了类风湿关节炎小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8及TLR9的水平,但TLR8与TLR9的表达无相关性。     

人脐带间充质干细胞来源的exosomes对脂多糖诱导的肝星状细胞活化的抑制研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)来源的外体(exosomes,hucMSC-Ex)对脂多糖(LPS)诱导的人肝星状细胞系LX2活化的抑制作用及其可能机制。方法体外培养LX2细胞,分别设PBS对照组、LPS组(100 ng/mL)及hucMSC-Ex组(LPS+150μg/mL hucMSC-Ex),48 h后收集细胞并提取相应的RNA及蛋白质。western blot检测LX2活化相关指标(α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白)和凋亡指标(Bcl2、Bax及caspase3蛋白)的表达情况;RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测α-SMA mRNA表达水平;MTT法分析hucMSC-Ex对LX2细胞活化后增殖的影响。结果 LPS可刺激LX2细胞活化,活化后的LX2细胞形态由不规则形状向成纤维细胞样改变,并高表达α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白,其灰度值分别上升约2.45、2.34、2.77倍(P均0.05);Bax及caspase3蛋白表达下降而Bcl2蛋白表达增强;LX2增殖能力增强;经hucMSC-Ex处理后,细胞形态由细长向不规则形态转变,α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白表达减弱,高表达Bax及caspase3蛋白而Bcl2蛋白表达下降,且细胞增殖减少(F=23.44,P0.05)。结论 hucMSC-Ex能够抑制LPS诱导的LX2细胞活化,降低其增殖能力并促进细胞凋亡。     

胃癌组织中干细胞标志物 Sox2 的表达及临床意义

摘要： 目的 探讨胃癌组织中干细胞标志物 Sox2 的表达及临床意义。方法 RT-PCR 检测 60 例胃癌患者癌组 织（胃癌组）和癌旁组织（癌旁组）中 Sox2 mRNA 表达, 免疫组织化学法检测 2 组 Sox2 蛋白表达水平。比较 Sox2 mRNA 阳性表达情况在不同年龄、 性别、 肿瘤大小、 组织类型、 TNM 分期、 分化程度、 浸润深度及淋巴结转移中的差 异。结果 胃癌组 Sox2 mRNA 阳性表达率 53.3% （32/60） 高于癌旁组的 20.0%（12/60）; Sox2 mRNA 的相对表达强度 高于癌旁组（0.724±0.209 vs. 0.256±0.065, P＜0.01）。胃癌组 Sox2 蛋白的阳性表达率 50.0%（30/60）高于癌旁组的 16.7%（10/60, P＜0.01）。胃癌组 Sox2 mRNA 阳性表达率临床 TNM 分期（Ⅲ＋Ⅳ）组高于（Ⅰ＋Ⅱ）组, 低、 未分化组 高于中、 高分化组, 浸润深度 T3～T4组高于 T1～T2组, 淋巴结转移组高于无转移组（均 P＜0.05 或 P＜0.01）。结论 胃癌组织中 Sox2 高表达与其发生、 侵袭、 进展及转移有关, 可作为胃癌诊疗新的分子标志物。     

骨髓间充质干细胞下调类风湿性关节炎小鼠脾脏单个核细胞TLR8及TLR9的表达

背景：间充质干细胞能够缓解类风湿性关节炎小鼠的症状,但是其机制还不清楚。目的：观察骨髓间充质干细胞对类风湿性关节炎小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8及TLR9等的影响。方法：DBA/1J小鼠随机分3组,非造模组不造模,阳性对照组和实验组制备Ⅱ型胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎模型。实验组尾静脉注射移植大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论：与阳性对照组比较,实验组小鼠关节直径明显减小,关节炎症细胞浸润程度明显降低,但比非造模组略高;小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8、TLR9和白细胞介素1β的水平较阳性对照组明显降低（P〈0.01或P〈0.05）;阳性对照组与实验组中TLR8与TLR9的表达均无明显相关性（P〉0.05）。说明骨髓间充质干细胞下调了类风湿关节炎小鼠脾脏单个核细胞表达TLR8及TLR9的水平,但TLR8与TLR9的表达无相关性。     

LacZ转基因小鼠间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究

摘要：目的：分离培养LacZ转基因小鼠骨髓间充质干细胞(LacZ-MSC),研究其生物学特性。 方法：用全骨髓贴壁法分离LacZ-MSC,体外扩增,并观察细胞生长特性,流式细胞仪检测细胞周期,成骨成脂诱导试验分析LacZ-MSC转分化特性, X-gal染色法检测其LacZ基因的表达。 结果：LacZ-MSC培养4 d后有散在呈针尖状的贴壁细胞,5~8 d后形成集落或融合呈纤维状;体外扩增每只小鼠原代可获得(1~3)×10⁵个细胞, 10代可获得(1~3)×10¹⁰个细胞总数,10代后的细胞增殖能力下降;细胞周期分析显示,G₀/G₁期：占78.44%,G₂/M期：占5.20%,S期：占16.36%;成骨成脂诱导试验表明,LacZ-MSC细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能;X-gal染色结果表明,LacZ-MSC细胞携带LacZ基因。 结论:从LacZ转基因小鼠骨髓中成功地分离了携带有LacZ基因的MSC,在体外具有较好的增殖更新能力,3~10代的LacZMSC作为组织工程细胞具有广阔的应用前景。