抗Sclerostin单链抗体基因的构建、表达及活性分析

目的 构建抗Sclerostin（SOST）单链抗体原核表达载体并对表达蛋白进行活性分析.方法 提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体轻链可变区基因（VL）和重链可变区基因（VH）并通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法,在VL和VH基因之间引入Linker（Gly4Ser）3,连接成单链抗体SOST-scFv（VL-Linker VH）.将scFv基因克隆至表达载体PET-22b（＋）后转入HEK293细胞进行分泌表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA和West-blot检测表达蛋白的反应活性,茜素红结节染色法评估单链抗体对体外培养骨髓间充质干细胞成骨矿化的影响.结果 VL基因序列全长为339个碱基对,VH基因序列全长330个碱基对,均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,而SOST-scFv基因全长包括4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）以及具有抗体特征性的2个半胱氨酸残基;本研究构建的scFv全长687个碱基对,VL-Linker-VH为连接结构,SDS-PAGE分析表明大肠杆菌表达的scFv为可溶性蛋白,ELISA和West-blot检测证实表达scFv具有与SOST特异性结合的活性,细胞实验结果证实scFv能够促进骨髓间充质细胞成骨分化及矿化结节的形成.结论 成功构建抗SOST单链抗体表达载体,而且表达的scFv产物具有确切的免疫结合活性以及体外诱导成骨分化、矿化作用,为该抗体应用于骨质疏松疾病治疗奠定了实验基础.     

冰毯术中、术后亚低温治疗重型创伤性脑损伤的疗效

目的 观察冰毯术中、术后亚低温对重型创伤性脑损伤(severe traumatic brain injury,sTBI)的疗效. 方法 选择GCS 3～8分sTBI患者20例,按随机数字表法分为冰袋降温组(Bag组)和冰毯降温组(Blanket组),每组10例.前者用冰袋置大血管处降温,后者用冰毯(设定鼻咽温33 ～34℃)降温,均维持术中和术后48 h.两组均于术前10 min(To)和术后8,12,24,48,72 h(T1、T2、T3、T4、T5)记录颅内压、脑灌注压(CPP)和GCS评分;T0、T3、T4、T5及术后96 h(T6)取静脉血以ELISA法测定血清神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)和S-100β蛋白浓度.记录术后6个月格拉斯哥预后评分(GOS).结果 Bag组T1～T5时体温较T0降低不显著(P＞0.05),NSE(T3～T6)、S-100β(T3～T6)及MBP(T4～T6)升高(P ＜0.05或0.01);颅内压T2～ T5时较T1升高,CPP T3 ～T5时降低(P＜0.05).Blanket组体温T1～T5时较T0显著降低(P ＜0.001); NSE(T3～T6)、MBP(T5 ～T6)及S-100β(T4～T6)升高(P ＜0.05或0.01);颅内压T2～T6时较T1升高(P＜0.05),CPP降低不显著(P＞0.05).与Bag组比较,Blanket组体温(T1～T5)低,颅内压(T2～T5)低,CPP(T3～T5)高,NSE(T4 ～T6)、MBP(T4～T6)及S-100β(T6)低(P＜0.05或0.01).两组GCS和GOS评分差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 冰毯术中、术后亚低温治疗可减轻sTBI患者的脑损伤程度.     

A novel distinguishing system for the diagnosis of malignant pancreatic cystic neoplasm

Purpose

To explore a simple and reliable non-invasive distinguishing system for the pre-operative evaluation of malignancy in pancreatic cystic neoplasm (PCN).

Methods

This study first enrolled an observation cohort of 102 consecutive PCN patients. Demographic information, results of laboratory examinations, and computed tomography (CT) presentations were recorded and analyzed to achieve a distinguishing model/system for malignancy. A group of 21 patients was then included to validate the model/system prospectively.

Results

Based on the 11 malignancy-related features identified by univariate analysis, a distinguishing model for malignancy in PCN was established by multivariate analysis: PCN malignant score = 2.967 × elevated fasting blood glucose (FBG) (≥6.16 mmol/L) ± 4.496 × asymmetrically thickened wall (or mural nodules ≥ 4 mm) ± 1.679 × septum thickening (≥2 mm) − 5.134. With the optimal cut-off value selected as −2.8 in reference to the Youden index, the proposed system for malignant PCN was established: septum thickening (>2 mm), asymmetrically thickened wall (or mural nodules > 4 mm), or elevated FBG (>6.16 mmol/L, accompanying commonly known malignant signs), the presence of at least one of these 3 features indicated malignancy in PCN. The accuracy, sensitivity and specificity of this system were 81.4%, 95.8% and 76.9%, respectively. MRI was performed on 32 patients, making correct prediction of malignancy explicitly in only 68.8% (22/32). The subsequent prospective validation study showed that the proposed distinguishing system had a predictive accuracy of 85.7% (18/21). Moreover, a higher model score, or aggregation of the features in the proposed system, indicated a higher grade of malignancy (carcinoma) in PCN.

Conclusion

Elevated FBG (>6.16 mmol/L), asymmetrically thickened wall (or mural nodules > 4 mm) and septum thickening (>2 mm) are of great value in differentiating the malignancy in PCN. The developed distinguishing system is reliable in the diagnosis of malignant PCN.     

猕猴血浆中SARS冠状病毒主蛋白酶肽类抑制剂N3的测定

目的建立测定猕猴血浆中N3的LC-MS/MS法。方法以ffiOBasiCC18（100mm×2.1 mm,5μm）色谱柱为 分析柱,流动相为乙腈-水（含0.2%甲酸）（55：45, F：F）,采用电喷雾离子源（ESI）,正离子扫描方式,选择离子反应监测 （SRM）模式检测,用于定量分析的离子反应为m/z681.3-402.3。结果血浆中的N3用乙腈沉淀蛋白后,样品经LC-MS/MS 系统进行检测。在优化后的样品预处理、色谱及质谱条件下,LC-MS/MS法检测猕猴血浆中的N3,线性范围为20 -2500 μg·L^-1,准确度RE范围为-12.9% -2. 9 %,日内、日间精密度的RSD分别小于7.5% （ n =6）和7.8% （ n =18）;低、中、高 3个浓度（50、1000和2000μg·L^-1）犯质控样品的提取回收率分别为75.5 %、77.3 %和79.6 %。结论结果表明,该方法 具有灵敏、准确、快速等优点,适用于N3在猕猴体内的药代动力学研究。     

重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂制备及相关研究

目的制备重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂,并对制剂稳定性及刺激性进行考察。方法选择玻璃酸钠为赋形剂,苯扎氯铵为抑菌剂,EDTA-2Na为稳定剂组成适宜的重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂处方,按滴眼剂配制要求配制,以外观、理化性质、含量等为考察指标,采用紫外光谱法及Draize法分别对其稳定性与刺激性进行评价。结果重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂为无色透明液体,制剂在低温条件下可稳定保存至少3个月,Draize评分〈3分,其余各项指标符合国家标准。结论重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂处方合理,性质较稳定,无刺激性。     

肠道病毒71型景德镇分离株全基因组序列分析

目的分析2011年景德镇地区重症手足口病患儿标本肠道病毒71型(EV71)分离株2011JDZ35全基因组序列特征。方法采集重症手足口病患儿咽拭子标本,进行病毒分离和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增分离病毒的全基因组序列,并进行全基因组核苷酸序列测定,参考EV71 A、B、C各基因型的参考毒株和国内外分离毒株进行同源性分析并构建系统发生树。结果 2011JDZ35株的基因组长度为7406 bp,其中包括5’端非编码区(5’UTR)长742 bp,病毒基因组编码区(ORF)全长6582 bp及3’端非编码区(3’UTR)长82 bp。ORF编码含2193个氨基酸残基的多聚蛋白。2011JDZ35株基因组的结构与FY08-C30-P14、EV71/Ningbo.CHN/065/2010、HZ08/Hang-zhou/2008十分接近,整个基因组的核苷酸同源性分别为97.3%,97.3%,97.7%;氨基酸同源性为99.1%,99.2%,99.2%。均属于C4亚型,而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)及EV71国际标准株BrCr(U22521)差异较大,核苷酸同源性分别仅为77.5%,80.0%;氨基酸同源性为89.8%,94.8%。结论 EV71型病毒2011JDZ35株全基因组的组成和结构符合肠道病毒特征,与其他EV71型病毒具有相同的基因组结构,2011JDZ35株与中国大陆浙江宁波株亲缘关系最近,与阜阳株和杭州株等中国大陆内陆地区分离株较近,而与马来西亚、我国台湾、厦门分离株的差异较为明显,与国际标准株则有较大差异;2011JDZ35株与浙江宁波株具有共同的进化途径,推断2011JDZ35株与浙江宁波株可能共同来源于2008年中国大陆地区流行的EV71病毒株同一种系。     

18F-FLT PET显像预测肿瘤放射敏感性的实验研究

目的 探讨18 F-FLT PET显像能否预测肿瘤放射敏感性.方法 对乳腺癌MDA-MB-231细胞和脑胶质瘤LN229细胞以6 MVX线照射0、8和16Gy后分别行克隆形成细胞存活率实验和18 F-FLT细胞摄取实验,各剂量组2种细胞的数据差异行t检验,同种细胞放疗前(0 Gy)与放疗后数据差异行单因素方差分析.将MDA-MB-237和LN229细胞分别接种至雌性BALB/c nu/nu裸鼠右后肢外侧皮下,待肿瘤直径长至10 mm时,将2种荷瘤鼠均按0、8和16 Gy分组(随机数字表法),每组20只.各组按相应剂量放疗后分别行18F-FLT PET显像和免疫组织化学检测,计算肿瘤与肌肉的SUV比值(T/M)和TK1标记指数(LITK1),并行相关性分析.结果 8Gy辐照后MDA-MB-231细胞和LN229细胞生存分数分别为(59.73±4.3)％和(93.41±3.75)％(t=-13.20,P＜0.001),16 Gy时两者生存分数分别为(43.57±4.06)％和(81.77±4.42)％(t=-14.24,P＜0.001).8Gy辐照后1 h MDA-MB-231细胞18F-FLT摄取降至(18.32±1.38) kBq/105细胞[0Gy时为(128.22±8.24) kBq/105细胞,F=266.41,P＜0.01],72h内保持在较低水平;LN229细胞辐照后1h摄取降至(9.87±1.30) kBq/105细胞[0 Gy时为(134.88±6.59) kBq/105细胞,F=346.06,P＜0.01],后逐渐增加,72 h时升至(127.17±9.08) kBq/105细胞(F =346.06,P＞0.05);16 Gy时2种细胞摄取变化基本同8Gy组.8 Gy放疗后裸鼠MDA-MB-231移植瘤18 F-FLT摄取在第1天T/M比值下降至0.78±0.39(放疗前为2.84±0.29,F=39.78,P＜0.01),后缓慢升高,在第7天时仍低于放疗前水平(F=39.78,P＜0.01);16 Gy时变化基本同8Gy组.LN229移植瘤8 Gy放疗在第1天T/M比值升高至2.41±0.47(放疗前为1.58±0.29,F=34.01,P＜0.05),后逐渐降低,到第7天降至0.66±0.32(F=34.01,P＜0.05);16 Gy放疗后18 F-FLT摄取值持续下降,至第7天降到0.44±0.22 (F=41.85,P＜0.01).2组细胞移植瘤8Gy和16 Gy放疗后18F-FLT摄取与TK1表达相关(8 Gy:r =0.67,0.73; 16 Gy:r =0.73,0.69,均P＜0.01).结论 实验结果示18F-FLT PET显像能够预测肿瘤放射敏感性,能否应用于临床需进一步研究.     

正常膝关节周围肌肉DTI纤维示踪成像b值探讨

目的探讨膝关节周围肌肉DTI成像的最佳b值及相关参数。方法选取15例健康志愿者,男7例,女8例,年龄20～30岁,平均年龄25岁,行膝关节常规MR检查包括冠状T1WI、FS-T2WI,矢状位T2WI、PDWI及轴位T1WI,DTI(b值分别为400,500,700s/mm2)检查,重建出ADC图,eADC图,FA图及FA彩色编码图,通过DTI纤维示踪(fiber tracking)显示膝关节周围肌肉纤维束连续性和走行方向,分析比较不同b值情况下同一块肌肉肌纤维成像的清晰度与完整性,选择肌肉成像的最佳b值,并测量最佳b值时不同肌肉的ADC值、eADC值及FA值,分析不同肌肉同一b值的DTI参数有无差异。结果不同b值在同一块肌肉中成像质量有统计学差异,b值为500s/mm2的肌肉成像质量优于b值为400s/mm2,700s/mm2时的肌肉成像质量;b值为500s/mm2时不同肌肉的ADC值、eADC值及FA值无明显统计学差异。结论肌肉DTI成像最佳b值为500s/mm2,此时不同肌肉DTI参数无明显统计学差异。     

能谱CT动态增强在肝硬化诊断中的初步研究

目的:探讨能谱CT动态增强在肝硬化诊断中的应用价值。方法:35例接受能谱CT扫描者纳入研究,其中10例无肝脏疾病的患者作为对照组,25例经临床诊断为肝硬化的患者作为肝硬化组。依据Couinaud分段法将肝脏分为Ⅰ～Ⅷ段,并分别测量动脉期及门脉期单能量为70keV时肝脏各段的CT值,碘浓度,水浓度及有效原子序数值(Eff-Z),并对对照组和肝硬化组进行比较研究。结果:动脉期扫描图像分析结果显示,肝硬化组患者的肝实质呈不均匀轻度强化,与对照组相比,Ⅱ段及Ⅳ段70keV的CT值有所下降,且具有统计学意义(肝硬化组与对照组单能量为70keV的CT值在Ⅱ段分别为77±9HU,71±7HU;Ⅳ段分别为79±11HU,72±7HU),其他各段70keV的CT值改变均无统计学意义;动脉期Ⅰ至Ⅷ段的碘浓度、水浓度及Eff-Z与对照组相比均无统计学意义。门脉期,肝硬化组的肝实质强化较均匀,与对照组相比,门脉期Ⅰ段至Ⅷ段70keV的CT值,Eff-Z和碘浓度均有所下降,且均具有统计学意义,门脉期Ⅰ至Ⅷ段的水浓度与对照组相比均无统计学意义。结论:肝硬化组的能谱CT动态增强扫描尤其是门脉期扫描的各能谱成像参数和对照组之间有差别,提示能谱CT扫描对诊断肝硬化具有一定的参考价值。     

高住低练对大鼠骨骼肌PI3K/PKB/mTOR信号通路基因表达的影响

目的:探讨高住低练对大鼠骨骼肌PI3K/PKB/mTOR信号通路基因表达的影响。方法:40只8周龄SD大鼠适应训练后,随机分为低住安静组(LC)、低住低练组(LoLo)、高住安静组(HC)和高住低练组(HiLo)。高住组每天低氧暴露12 h(氧浓度13.6%,相当于海拔3500 m),低练组进行35 m/min、1 h/d、5 d/周、共4周的跑台训练。采用实时荧光定量PCR检测大鼠腓肠肌PI3K、PKB、mTOR mRNA表达,以双因素方差分析进行统计。结果:低氧和运动均显著提高大鼠骨骼肌PI3K和PKB mRNA表达(P<0.01),但低氧和运动无显著交互作用(P>0.05);运动显著提高大鼠骨骼肌mTOR mRNA表达(P<0.01),低氧却显著降低mTOR mRNA表达(P<0.01),且低氧和运动有交互作用,显著降低mTOR mRNA表达(P<0.01)。结论:低氧和运动促进PI3K和PKB基因表达,低氧抑制而运动促进mTOR基因表达;HiLo训练促进PI3K和PKB基因表达,却抑制mTOR基因表达。不同条件下PI3K/PKB/mTOR信号通路基因表达水平不一致。