三七总皂苷调控PI3K/AKT信号通路预防糖尿病大血管病变的机制

目的从PI3K/AKT信号通路研究三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)预防糖尿病大血管病变的机制。方法雄性SD大鼠分为对照组、模型组和治疗组,模型组和治疗组大鼠高脂饲料喂养6周后给予链脲佐菌素单次腹腔注射(30 mg·kg^-1体质量)建立2型糖尿病模型,成模后治疗组给予PNS灌胃干预(100mg·kg^-1体质量)。血糖仪检测大鼠空腹尾静脉血糖(FBG),ELISA法测定血清空腹胰岛素(FINS)和糖化血红蛋白(GHbA1c)水平,苏木素-伊红(HE)染色观察腹主动脉病理形态改变,荧光定量PCR检测腹主动脉标记物MMP2、MMP9、CD34、VEGF及PI3K、AKT mRNA相对表达,Western Blot法观察PI3K和AKT蛋白表达情况。结果模型组和治疗组大鼠在STZ注射造模后,FBG均显著高于对照组(P<0.01和P<0.01),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和治疗组血清INS均显著高于对照组(P<0.01和P<0.01),治疗组INS显著低于模型组(P<0.05)。HE染色显示,与对照组比较,模型组动脉壁变薄,平滑肌细胞增多,排列紊乱,内膜不光滑;治疗组较模型组明显改善。模型组MMP2、MMP9表达较对照组显著上调(P<0.05和P<0.01),治疗组MMP9较模型组显著下调(P<0.01)。模型组CD34、VEGF表达较对照组显著上调(P<0.05和P<0.01),治疗组CD34较模型组显著下调(P<0.05)。模型组大鼠PI3K表达较对照组显著上调(P<0.05),治疗组PI3K表达较模型组显著下调(P<0.05)。模型组PI3K蛋白、p-AKT蛋白表达均显著高于对照组(P<0.01和P<0.01),治疗组PI3K、p-AKT均显著低于对照组(P<0.01和P<0.05),模型组p-AKT/AKT显著高于对照组(P<0.05),治疗组p-AKT/AKT较模型组有显著降低趋势,且与对照组差异无统计学意义。结论PNS可能通过下调PI3K/AKT信号通路预防糖尿病大血管病变。     

愈肾汤总黄酮的成分组成和活性研究

目的:对愈肾汤总黄酮的化学成分和活性进行研究,为处方的活性成分揭示和作用机制阐明奠定基础.方法:采用体外H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤实验评价愈肾汤总黄酮的活性.并采用硅胶柱、大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶色谱和高效液相制备等方法分离纯化愈肾汤总黄酮的化学成分,根据理化性质和波谱数据鉴定其结构.结果:愈肾汤总黄酮具有明显的抗过氧化氢诱导的HUVEC损伤和下调PAI-1表达(P＜0.05)的作用.从愈肾汤总黄酮部位分离得到9个黄酮类化合物分别为毛蕊异黄酮(1)、蒙花苷(2)、3',4'-二羟基-7-O-β-D-葡萄糖苷(3)、3'-羟基-4'-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷(4)、槲皮素(5)、山柰酚(6)、芦丁(7)、红车轴草异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(8)、4'-羟基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(9).结论:愈肾汤总黄酮具有抗HUVEC氧化损伤作用,所分离的9个黄酮化合物均为首次从该方中分离得到,化合物1,3,4,8,9可能来自于黄芪,化合物2,5～7可能来自于小蓟和仙鹤草,其中3,4和9为首次从组方的单味药中分离得到.     

卵巢癌组织及腹腔积液中肿瘤干细胞的分离与培养

目的:从人卵巢癌组织和腹腔积液中分离培养肿瘤干细胞,分析细胞表型和化疗药物敏感性。方法:取卵巢浆腺癌患者的原发肿瘤组织及腹腔积液,通过无血清培养形成悬浮生长的球体。采用FCM及免疫荧光法检测干细胞标志物的表达。体外药敏实验检测获得的球体细胞和分化细胞对紫杉醇和卡铂的药物敏感性。结果:卵巢癌组织及腹腔积液中的卵巢癌细胞经无血清悬浮培养可以形成球体,后者具有CD44+CD24-表型并表达Oct4、Nanog及Sox2等干细胞标志物;腹腔积液及组织来源的球体细胞经血清培养液培养3周后发生分化,CD44+CD24-细胞比例分别下降至47%和3%;分化细胞对紫杉醇和卡铂的敏感性均显著高于球体细胞(P<0.01)。结论:卵巢癌的肿瘤干细胞属于CD44+CD24-细胞,后者表达Oct4等干细胞标志并具有显著耐药性。     

乳腺X线摄影中微钙化对乳腺导管内原位癌的诊断价值

目的 探讨乳腺X线摄影中微钙化对乳腺导管内原位癌(DCIS)的诊断价值.方法 回顾性分析住院治疗的163例乳腺肿物患者的临床资料,研究其乳腺X线摄影和病理检查结果,分析乳腺X线摄影诊断良、恶性肿瘤与病理诊断结果的一致性和乳腺X线摄影发现微钙化与病理诊断DCIS的一致性.结果 乳腺X线摄影诊断良性肿瘤44例,恶性肿瘤119例.病理检查结果诊断为良性肿瘤37例,恶性肿瘤126例.乳腺X线摄影诊断良、恶性肿瘤与病理诊断结果的一致性为中等(Kappa=0.492,t=6.323,P﹤0.01),诊断乳腺癌的敏感度为84.92％(107/126),特异度为67.57％(25/37),阳性预测值为89.92％(107/119),阴性预测值为56.82％(25/44).乳腺X线摄影发现微钙化与病理诊断DCIS的一致性较差(Kappa=0.181,t=3.125,P﹤0.01).乳腺X线摄影发现微钙化对DCIS诊断的敏感度为77.78％(21/27),特异度为55.15％(75/136),阳性预测值为25.61％(21/82),阴性预测值为92.59％(75/81).结论 乳腺X线摄影能够作为临床筛查乳腺癌的有效手段,但是单纯寻找微钙化以诊断DCIS效能较低,不能作为诊断DCIS的标准.     

CXCRl/CXCR2受体拮抗剂-G31P抑制前列腺癌血管新生的体内实验

目的 探讨G31P(CXCR1/CXCR2受体拮抗剂)对人前列腺癌PC-3细胞的体内血管新生的抑制作用.方法 建立体内绿色荧光蛋白(GFP)标记的人雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3的裸鼠原位移植瘤模型,观察G31P对裸鼠前列腺原位移植瘤血管新生的影响.结果 与对照组(1.26±0.46)相比,G31P处理组明显抑制前列腺肿瘤的血管新生(0.49±0.12,P＜0.05),与对照组相比,G31P处理组VEGF(P＜0.01)和NF-kB(P＜0.01)的表达具有统计学意义(免疫组织化学法).结论 在裸鼠原位移植瘤模型中G31P对人雄激素非依赖性前列腺癌的血管新生有明显抑制作用.     

红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立

背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。     

维拉帕米对体内外胰腺癌SW1990细胞侵袭转移影响及其机制探讨

目的探讨三磷酸腺苷结合转运蛋白G家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2)抑制剂维拉帕米对体内外胰腺癌SW1990细胞侵袭转移能力影响及其机制。方法以终浓度分别为0、12.5、25、50、100和200μmol/L维拉帕米处理SW1990细胞24、48和72h后,以CCK-8法检测维拉帕米对SW1990细胞增殖抑制影响;RT-PCR和蛋白质印迹法检测维拉帕米对体内外SW1990细胞ABCG2mRNA及蛋白表达水平的影响;Transwell小室侵袭迁移实验及划痕实验分析维拉帕米处理后细胞侵袭迁移能力的改变。将SW1990细胞接种至裸鼠皮下,对比观察维拉帕米干扰前后肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤情况;免疫组化分析裸鼠肿瘤组织中ABCG2的表达。结果 CCK-8检测结果显示,浓度为25~100μmol/L维拉帕米对胰腺癌SW1990细胞的抑制呈现明显的剂量及时间依赖性。划痕实验结果显示,细胞平均迁移率比较,划痕24h维拉帕米组为(19.2±2.04)%,对照组为(36.8±2.25)%,t=-17.23,P<0.001;48h维拉帕米组为(43.7±3.14)%,对照组为(78.4±2.67)%,t=-23.85,P<0.001。Transwell侵袭实验结果显示,维拉帕米组平均穿膜细胞数为46.6±3.3,明显少于对照组的90.2±2.7,t=-47.2,P<0.001;迁移实验结果显示,维拉帕米组平均穿膜细胞数为61.4±2.8,亦少于对照组的110.3±3.5,t=-39.5,P<0.001;蛋白质印迹法及RT-PCR结果显示,维拉帕米能够明显降低体内外SW1990细胞ABCG2蛋白及mRNA的表达水平。裸鼠成瘤实验结果显示,细胞接种后10d左右可见肿瘤结节,50d时维拉帕米组裸鼠肿瘤体积为(521.6±48.5)mm3,小于对照组的(1 496.6±73.1)mm3,t=-38.6,P<0.001;维拉帕米组瘤质量(0.53±0.18)g,明显低于对照组(1.61±0.45)g,t=-22.49,P<0.001。免疫组化结果显示,维拉帕米能明显降低SW1990细胞ABCG2的表达。结论维拉帕米能明显抑制胰腺癌SW1990细胞在体内外的侵袭和转移,其机制可能与维拉帕米下调ABCG2的表达有关。     

PI3K-AKT-mTOR信号通路在伯基特淋巴瘤中的活化

目的 探讨PI3K-AKT-mTOR信号通路在伯基特淋巴瘤中的活化情况.方法 收集13例伯基特淋巴瘤患者淋巴瘤组织及14例患者淋巴结反应性增生组织病理切片,采用免疫组织化学方法检测AKT、mTOR、RPS6磷酸化情况.结果 伯基特淋巴瘤组织中p-AKT、p-mTOR、p-RPS6表达率分别为84.6％(11/13)、100.0％(13/13)、100.0％(13/13),反应性淋巴结增生为64.2 ％(9/14)、71.4％(10/14)、78.6 ％(11/14),阳性表达率差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 PI3K-AKT-mTOR信号通路在伯基特淋巴瘤中存在异常活化.     

诱导建立乳腺癌MCF-7放射耐受细胞亚株的实验研究

  目的  探索诱导并建立人乳腺癌MCF-7放射耐受细胞亚株的体外实验方法。  方法  体外培养MCF-7细胞株, 应用梯度递增的X线对MCF-7进行诱导照射, 照射剂量达到59Gy时, 得到放射耐受细胞亚株(MCF-7R), 扫描电镜和透射电镜观察亲本株MCF-7与放射耐受细胞亚株MCF-7R细胞超微结构, 流式细胞仪检测其细胞周期分布, 集落形成实验检测其放射敏感性, 并计算存活分数, 多靶单击模型拟合细胞存活曲线。  结果  与MCF-7相比, MCF-7R外形及细胞器均出现明显改变; G₂/M期比例明显降低; (13.32%vs.9.43%)放射敏感性参数SF₂即照射2 Gy时的细胞存活分数升高34%(P < 0.001), 准域剂量Dq值由2.261 Gy升高至3.695 Gy(P < 0.05), 平均致死剂量D_o值由1.215 Gy升高至1.834 Gy(P < 0.05)。  结论  照射剂量梯度递增法是可行的建立人乳腺癌放射耐受细胞亚株的方法, 得到的放射耐受亚株细胞形态及细胞生物学特性与亲本株细胞相比较有明显差异。      

一种新的循环肿瘤细胞检测平台在膀胱癌诊疗中的初步应用

目的 初步探索一种新的循环肿瘤细胞(CTC)检测平台在膀胱癌诊疗中的应用.方法 选取膀胱癌患者10例为试验组,健康志愿者5例为对照组.10例患者均接受经尿道膀胱肿瘤电切术.术前分别取试验组和对照组的外周全血样本10 ml、尿液样本10 ml,术后再次取试验组的外周全血、尿液样本各10 ml.使用Celsee PREP 400TM循环肿瘤细胞检测平台分别检测所有样本中所含CTC,对比术前试验组与对照组血、尿样本中的CTC,对比试验组术前、术后的CTC.随访12个月,监测患者是否出现复发或进展.结果 试验组术前血样本中均发现CTC,中位数为4个(1~9个);对照组均未发现CTC.试验组术后血样本中,8例(80%)发现CTC,中位数为1.5个(1~4个),2例(20%)未发现CTC.膀胱癌患者术前与术后血样本中的CTC比较,差异有统计学意义(P=0.014).尿液样本因杂质堵塞微通道而无法检测样本中的CTC.随访1年,患者无疾病进展/复发生存率为80%.结论 Celsee PREP 400TM循环肿瘤细胞检测平台可有效检测血样本中的CTC,值得进一步探索其在膀胱癌诊疗中的应用.