我国脑膜炎奈瑟菌孔蛋白PorA、PorB的多态性分析

目的以蛋白质组学研究为基础,分析2003—2005年我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株特征,建立以致病性相关蛋白多态性为目标的新分型方法。方法利用双向电泳和MALDI-TOF质谱鉴定分析2003—2005年流脑流行期内分离的66株C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的蛋白表达,重点分析与致病性相关的蛋白多态性特征。结果根据孔蛋白PorA、PorB在双向电泳中的多态性,建立了12个特征菌型。安徽菌株的PorA和PorB蛋白电泳谱型显示出了高度的一致性,而其他地区的菌株则显示出高度的多态性。结论PorA和PorB蛋白2-DE电泳谱型可以作为一种新的菌株分型方法,可能在菌型变迁检测和流脑暴发预警中具有重要应用前景。     

我国HIV-1 B''亚型毒株gag基因变异特征研究

目的研究我国人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B’亚型主要流行株在宿主免疫压力下的基因变异及抗原表位的变化特征，探讨选择压力、基因离散率和抗原表位变化之间的关系。方法从确诊的HIV-1感染者的全血样本中提取基因组DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增后，将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析，使用GCG软件包的Distance程序对P17和P24两个区段计算基因距离，用Diverge程序计算同义替换（1（s）和非同义替换（1（a）及二者之间的比值，并对我国人群中较常见的HLA型别限制的CTL表位的突变情况进行分析。结果HIV-1B’亚型毒株的P17区段的Ks／Ka值〈1，而P24区段的Ks／Ka值〉1；P24部分的基因离散率低于P17部分；P17区段抗原表位的保守率为34．94％，而P24区段抗原表位的保守率为67．38％；从基因离散率、所受的选择压力及抗原表位的突变率3个方面来看，HIV-1的P17区段均明显大于P24区段。结论HIV-1B’亚型毒株的P17区段的抗原表位变化较大，而P24区段的抗原表位相对较为保守。提示P24区段的CTL表位更适合于表位疫苗的研制。     

荧光定量PCR法在重组逆转录病毒pLXSN-BDNF滴度测定中的应用

目的制备含大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）基因的逆转录病毒，建立荧光定量PCR测定滴度的方法。方法扩增BDNF基因，构建重组质粒pLXSN-BDNF，将其转染包装细胞，经G418筛选、病毒浓缩后用荧光定量PCR法和克隆形成法测定滴度。结果经PCR、酶切和测序鉴定，BDNF基因成功插入逆转录病毒载体中，筛选得到稳定的分泌重组病毒细胞系。重组病毒100倍浓缩后经荧光定量PCR法和克隆形成法测定的滴度分别为6．92×10^6拷贝/ml和3．2×10^5CFU/ml，两种方法测得的结果差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功扩增BDNF基因，制备了重组病毒pLX—SN-BDNF，建立了荧光定量PCR检测滴度的方法，为基因治疗青光眼性视神经损伤的实验研究提供重要参考指标。     

EIAV减毒疫苗诱导马外周血单个核细胞Th1型细胞因子的转录

目的：探讨马传染性贫血病毒驴白细胞减毒疫苗免疫马后,外周血单个核细胞中Th1型细胞因子转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法：应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立了马PBMC中IFNγ-、IL-2、IL-12 mRNA转录水平的定量检测方法,定期观察4组（疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组、自然感染组）12匹马外周血PBMC中细胞因子的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后细胞因子转录水平的变化。结果：DLV免疫马,在免疫后3周外周血PBMC中IFN-γ、IL-2转录量显著高于阴性对照组及自然感染组（P〈0.01）;免疫后用EIAV强毒株攻击,IFNγ-、IL-2和IL-12转录的量明显升高,免疫马获得完全保护;强毒株攻击阳性对照马IFN-γ、IL-2转录量随疾病进展波动,发热期下降。结论：本研究首次证明EIAV减毒疫苗可诱导马外周血PBMC中IFN-γ、IL-2、IL-12基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关,此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。     

人vWF-A1区蛋白的表达及其对血小板聚集的抑制作用

目的:进一步研究血栓形成的机制,开发抗血栓药物。方法: 应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vWF-A1区蛋白,经过纯化、复性,获得重组蛋白(rvWF-A1),同时用流式细胞术检测rvWF-A1与血小板膜糖蛋白血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)Ib的结合能力,应用血小板聚集仪测定rvWF-A1对瑞斯托霉素(ristocetin)诱导的血小板聚集抑制作用。结果: 重组表达载体pQE-31-vWF-A1在大肠杆菌M15中得到高效表达,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白的30%,Ni-NTA agrose柱纯化后,其纯度为95%,经复性的rvWF-A1蛋白具有良好的生物学活性。它可与血小板模糖蛋白血小板膜糖蛋白GPIb结合,阳性率为78.6%;它可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集,抑制率为84.7%。结论: 在原核细胞中可以成功地高效表达人vWF-A1区蛋白,该重组蛋白有可能开发为有效的抗血栓药物。     

血红素加氧酶1延长异种心脏移植存活的机制研究

探讨血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)在器官移植中抗急性血管排斥反应的作用。通过建立豚鼠到SD大鼠异位心脏移植模型,用血红素(hemin)分别诱导供者和受者,上调HO-1基因表达;用眼镜蛇毒因子、环孢素A抑制超急性排斥反应;观测供者心脏存活时间,并分别检测心脏组织HO-1表达、受者血清异种抗体IgM的变化及异种抗体IgM和C3在血管内膜的沉积;采用TUNEL方法检测心脏组织细胞凋亡;RT-PCR方法测定组织CD40L mRNA表达水平。结果显示:上调HO-1表达能明显延长心脏移植存活时间,抑制异种抗体IgM表达和在血管内膜的沉积,减少心肌细胞的凋亡并且抑制CD40L mRNA的表达。该结论表明HO-1通过介导CD40-CD40L共刺激途径抑制大鼠异种心脏移植后急性血管排斥反应,延长心脏移植存活时间。     

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒（FMDV）感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据。方法利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白（VP1epi）作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度。结果FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的。结论VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒。     

陕西、青海、新疆三省(区)部分人群庚型肝炎病毒血清学调查

目的：调查陕西、青海、新疆三省（区）部分人群庚型肝炎病毒（HGV／GBV）血清学特征。方法：采用ELISA方法，共调查三省（区）1469份血清中GBV－IgG抗体。结果：少数民族血清GBV－IgG抗体的阳性率（藏族4．11％，蒙古族5．36％，维吾尔族4．55％，回族4．00％）略高于汉族（1．36％－1．73％），但差异无显著性（P＞0．05）；吸毒人群GBV－IgG阳性率（11．30％，34／301）明显高于正常人群（2．44％，18／736），（P＜0．01）；献血员GBV－IgG阳性率为1．02％－7．68％。结论：三省区民族间GBV－IgG抗体阳性差异无显著性，血源性传播是其重要途径，应加强对献血员及吸毒人员的监管。     

浙江畲族DYS287、DYS440位点的多态性研究

目的　研究浙江畲族人群中DYS2 87和DYS44 0位点的多态性。方法　采用聚合酶链反应扩增DYS2 87和DYS44 0 ,PCR产物用 2 %的琼脂糖电泳分析 10 0名畲族个体的基因型。结果　 10 0名个体DYS2 87位点全部是YAP-;没有发现YAP ;10名为DYS44 0 3 ,占总人群数的 10 % ,其余 90名是DYS44 0 4。结论　浙江畲族人群DYS2 87和DYS44 0多态性与属于汉藏语系的其它民族之间存在着明显的不同 ,因此这两个基因位点对研究人类的进化是一种稳定的、重要的遗传标记。     

早期HIV-1感染env基因的动态变异研究

目的 追踪观察HIV-1新发感染者体内CRF07_BC重组毒株膜蛋白基因的变异性.方法 从HIV-1感染者血浆中提取总RNA,通过逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)获得HIV-1 gp120全长及C2-C5区段基因.纯化后装入T载体,转化至Top10大肠埃希菌内增殖,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆,运用PCR方法进行鉴定,最后对所获得的目的克隆测序.结果从两个感染者血浆样品中获得感染后半年到2年半间多个时间点的gp120基因克隆共135个及gp120基因C2-C5区段克隆15个,分析显示这些克隆均为HIV-1 CRF07_BC亚型.随感染时间的延长,HIV-1 env基因的离散率与多样性均有增加的趋势.env基因同义突变与非同义突变比较结果显示,C1、C3与V4区段非同义突变比率比gp120基因的其他区域都高.基因多态性分析的结果显示,同一时间点内不同毒株基因在不同区段的变异是不同的,基因多样性介于0与0.066±0.028之间.结论 随着患者感染时间的推移,HIV-1膜蛋白基因的变异逐渐增大.C1、C3和V4区的高突变率提示,该基因区可能是HIV-1病毒生存与宿主免疫压力相互作用的主要位点.