Wortmannin阻断PI3K/AKT途径对食管癌缺氧诱导因子-1α及糖酵解的影响

目的 探讨人食管癌细胞TE1、TE13中应用wortmannin阻断PI3K/AKT通路对缺氧诱导因子(HIF)-1α的抑制效果及对糖酵解相关基因表达的影响,分析PI3K/AKT-HIF-1α途径对食管癌细胞糖酵解通路之间的关系.方法 wortmannin(2μmol/L)预处理食管癌细胞TE1、TE13后常氧和缺氧培养,分为①常氧组(N);②缺氧组(H);③常氧处理组(N+W);④缺氧处理组(H+W).采用Western印迹检测细胞中HIF-1α蛋白及己糖激酶(HK)-Ⅱ、葡萄糖载体蛋白(GLUT)-1、乳酸脱氢酶(LDH )-A等糖酵解相关基因蛋白的表达;实时定量PCR检测HIF-1α及HK-Ⅱ、GLUT-1、LDH-A等糖酵解相关基因mRNA的表达;分光光度法测定胞液中LDH、HK-Ⅱ活性和培养上清液中乳酸浓度.结果 常氧状态下,在TE1细胞中存在HIF-1α蛋白的表达,wortmannin(2 μmol/L)能抑制HIF-1α蛋白表达,12 h后抑制效应最明显,故选取12 h为后续实验的缺氧时间.TE1、TE13细胞经wortmannin预处理后HIF-1α、HK-Ⅱ、GLUT-1、LDHA蛋白表达较未加药细胞明显减弱(P＜0.05);HIF-1α、HK-ⅡmRNA表达较未加药细胞明显减弱(P＜0.05).常氧和缺氧条件下加用wortmannin的TE1,TE13组食管癌细胞胞液LDH、HK-Ⅱ活性均较未加药细胞组明显减弱(P＜0.05),未加药细胞缺氧后酶活性增强(P＜0.05).常氧和缺氧条件下加用wortmannin组较未加药组细胞上清液乳酸浓度明显减低(P＜0.05),加wortmannin组细胞缺氧后表达增强(P＜0.05).结论 常氧及缺氧条件下,wortmannin能通过抑制食管癌细胞HIF-1α和糖酵解相关基因的表达导致乳酸水平降低,表明PI3K/AKT- HIF-1α途径与食管癌细胞糖酵解通路密切相关.     

叉头状转录因子01对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的通过激活和抑制叉头状转录因子01（Fox01）活性及表达,探讨其对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞（MCs）氧化应激的作用。方法采用脂质体转染法将FoxOl短发夹样RNA（Fox01shRNA）质粒载体稳定转染MCs;用高糖（30．0mmol／L）和白藜芦醇（Resv20．0txmol／L）培养稳定转染后的MCs。以5．6mmol／L葡萄糖培养的MCs为正常对照组（NG）,将高糖培养的MCs分为5组：单纯高糖组（HG）、HG＋Resv组、HG＋Fox01shRNA转染组、HG＋Resv＋Fox01shRNA转染组、HG＋转染阴性对照组（shNC）。培养72h后,用荧光酶标仪检测各组MCs内活性氧（ROS）水平;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测去乙酰化酶（Sirtl）、Fox01、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）mRNA表达;Westernblotting法检测Fox01及磷酸化Fox01（p-Fox01）水平。多组间数据比较采用单因素方差分析。结果与NG组相比,HG组SirtlmRNA表达下降,p-Fox01水平升高,MnSODmRNA表达下降,ROS水平升高,差异均有统计学意义（t=12．38、13．27、14．13、8．36,均P〈0．05）。与HG组相比,HG＋Fox01shRNA转染组Fox01mRNA表达被抑制,MnSODmRNA表达更低,ROS水平更高,差异均有统计学意义（t=20．61、13．61、10．13,均P〈0．05）;HG＋Resv组SiitlmRNA表达升高,p-Fox01水平下降,MnSODmRNA表达升高,ROS水平下降,差异均有统计学意义（t=6．02、10．69、5．39、5．37,均P〈0．05）。与HG＋Resv组比较,HG＋Resv＋Fox01shRNA转染组,Fox01mRNA表达被抑制,MnSODmRNA表达降低,ROS水平升高,差异均有统计学意义（t=22．53、15．31、14．63,均P〈0．05）。结论Fox01是调节MCs内ROS水平的重要转录因子,其可能通过激活下游抗氧化靶基因MnSOD的表达,保护MCs对抗氧化应激。     

重组人源MPG基因真核表达载体构建及转染非小细胞肺癌多药耐药细胞的研究

目的构建人N甲基化嘌呤DNA糖基化酶(NmethylpurineDNAglycosylase,MPG)基因真核表达载体,并研究其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术构建pCMVScript/MPG重组真核表达载体;应用脂质体介导的基因转染技术将其导入人非小细胞肺癌多药耐药细胞株A549/CDDP内;应用G418筛选稳定表达的转染细胞;应用PCR检测pCMVScript载体上的NEOr基因,应用RTPCR及Westernblot检测MPG基因的表达。结果构建产物经限制性酶切分析及基因序列测定证实为pCMVScript/MPG重组表达载体;转染pCMVScript/MPG载体组(MP组)及转染pCMVScript载体组(P组)细胞内检测到NEOr基因,未转染组(C组)则未检测到;MP组细胞内MPGmRNA水平较P组及C组细胞显著增高(P<0.01);MP组细胞内MPG蛋白质水平较P组及C组细胞显著增高(P<0.01)。结论成功地构建了人MPG基因表达载体,并在人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/CDDP获得了稳定、高效的表达。     

非典型心绞痛人群冠心病诊断评分方案的创建及冠状动脉CT检查对其的影响

目的建立预测非典型心绞痛冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）可能性的诊断评分系统。方法回顾性分析3 420例入院疑诊冠心病且具有非典型心绞痛症状表现的患者的临床资料,对相关临床因素进行Logistic多因素回归分析,筛选危险因素并对危险因素依据比数比（odds ratin,OR）值分别赋予分值,同时计算危险得分,建立非典型心绞痛冠心病诊断评分方案。分析危险积分和冠心病发病率、冠状动脉病变程度的关系。通过计算受试者工作特性（receiver operating characteristics,ROC）曲线下面积检验该评分方案的应用效能。对冠状动脉计算机断层扫描（computerized tomographic scanning,CT）检查行危险因素分析,依据OR值赋值,将冠状动脉CT纳入诊断评分方案后计算ROC曲线下面积,检验评分方案应用效能的变化。结果非典型心绞痛冠心病发病率为63.68%。年龄、男性、吸烟史、糖尿病史、原发性高血压史及血脂异常为诊断评分方案（命名为ABCDDS方案）的6个因素。诊断评分方案ROC曲线下面积为0.723,标准误为0.010。危险积分范围：0～11分。危险积分越高,患者患冠心病的可能性越大。随着危险积分分值的增加,冠心病病变程度越重。冠状动脉CT积分7分,冠状动脉CT纳入诊断评分方案后,ROC曲线下面积增加至0.832。结论非典型心绞痛冠心病诊断评分方案简单、实用,可有效预测非典型心绞痛冠心病。冠状动脉CT可提高诊断评分方案的应用效能。     

CCK-8对内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及协同刺激功能的影响

目的： 探讨八肽胆囊收缩素（CCK-8）对内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激活性的影响。方法: 将BALB/c小鼠随机分组（n=4）,分别腹腔注射生理盐水（0.2-0.3 mL/mouse），LPS（100 μg/mouse）和/或CCK-8 (5 nmol/mouse)及CR1409（100 μg/mouse）、CR2945（100 μg/mouse）。12 h后收集并纯化腹腔巨噬细胞。采用流式细胞术分析细胞表面B7.1和B7.2含量的变化。用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4+T细胞，按4∶1数量比与上述处理的腹腔巨噬细胞共同体外培养，同时加入ConA 5 mg/L，采用［³H］掺入法测定CD4+T细胞增殖，反映巨噬细胞的协同刺激活性。结果: 整体应用CCK-8作用小鼠腹腔巨噬细胞，与对照组相比，CCK-8可上调静息小鼠腹腔巨噬细胞B7.2的表达，而对B7.1的表达则无影响；并且CCK-8使CD4+T细胞［³H］-TdR的掺入率升高，即促进其增殖，增强巨噬细胞的协同刺激活性。CCK-8降低LPS活化的内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2的表达并且降低CD4+T细胞的［³H］-TdR掺入率，即抑制其增殖，抑制其协同刺激活性。CR1409及CR2945均能逆转CCK-8的上述作用，且CR1409的作用较CR2945更明显。结论: CCK-8通过上调巨噬细胞B7.2表达而增强其协同刺激活性；并且降低LPS活化的内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2的表达，抑制其协同刺激活性。该作用由CCK1R及CCK2R共同介导，其中CCK1R起主要介导作用。     

二烯丙基三硫对急性肺损伤小鼠肿瘤坏死因子-α表达及核转录因子-kB活性的影响

目的 探讨二烯丙基三硫（DATS）对脂多糖（LPS）致急性肺损伤（ALI）小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达及核转录因子-kB（NF—kB）活性的影响。方法 复制LPS致ALI小鼠模型。实验动物按随机数字表法分为生理盐水对照组、ALI模型组、DATS预防组、DATS治疗组和DATS对照组。采用酶联免疫吸附法（ELLSA）测定各组血清和肺组织匀浆上清液中TNF—α浓度；用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测各组肺组织TNF-α mRNA表达；凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）检测肺组织NF—kB活性。结果 ALI模型组2h血清及肺组织TNF—α含量明显升高（P均〈0．01），6h有所降低，但仍高于生理盐水和DATS对照组（P均〈0．01）；DATS预防组2h和6h血清及肺组织TNF—α含量较ALI模型组均明显降低（P〈0．05或P＜0．01），但DATS治疗组无明显效果（P均〉0．05）。ALI模型组2h肺组织TNF—α mRNA表达较生理盐水对照组和DATS对照组均明显升高（P均〈0．01），DATS预防组可明显抑制肺组织中TNF—α mRNA表达（P〈0．05），但DATS治疗组无明显效果。ALI模型组肺组织NF～kB活性较生理盐水对照组和DATS对照组均明显升高（P均〈0．05），DATS预防组可明显抑制肺组织NF—kB活性（P〈0．05），但DATS治疗组的抑制效果不明显。结论 预先给予DATS可抑制LPS诱导的ALI小鼠肺组织NF—kB活性和TNF—α mRNA表达，减少血清及肺组织中TNF—α的生成，具有一定的抗ALI作用。     

南丁格尔志愿者对社区老年人服务的效果与体会

目的为社区老年人提供生理和心理援助,帮助社区老年人建立健康快乐的生活方式。方法通过组建南丁格尔志愿者队伍,开展健康知识讲座、健康保健服务、组织健康教育活动为社区老年人进行服务,采用一般资料自制问卷与生活满意度量表对老年人进行调查。结果 1年后,社区老年人对其生活的满意度和服药依从性较以往有所提高,慢性疾病发生率较以往降低。结论志愿者参与社区老年人服务活动,有助于提高老年人对生活的满意度和服药依从性。     

胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞

背景: 胰岛移植是治疗1型糖尿病包括部分2型糖尿病的有效方法.然而,供体来源的匮乏及移植免疫排斥反应极大地阻碍了该方法的推广和应用.最有希望的来源是从干细胞诱导分化出大量可供移植的胰岛细胞,但目前胰腺干细胞转分化方面的研究尚处于起步阶段.目的:寻找胰岛移植治疗糖尿病合适的细胞来源.方法:分离培养昆明小鼠胰腺导管上皮细胞,以添加有角化细胞生长因子、肝细胞生长因子和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养,不同时间取样本于光镜和电镜下观察,检测第1,16天时CK-19、PDX-1免疫化学染色变化并以半定量RT-PCR检测第1,16天时胰岛素和胰高血糖素基因表达情况,21 d时行双硫腙染色实验及葡萄糖刺激的胰岛素释放实验以检验胰岛样细胞的生理功能.结果与结论:分离第1天,大部分细胞CK-19染色阳性,偶可见PDX-1阳性细胞,16 d后,CK-19阳性细胞快速增殖形成细胞团,大部分细胞PDX-1染色阳性;RT-PCR显示培养细胞胰岛素和胰高血糖素表达明显增强,分别增加了5.4倍和6.1倍(P < 0.01);21 d时胰岛样细胞团更加成熟,双硫腙着色阳性,且对高糖(15 mmol/L)刺激的胰岛素释放较低糖(5.6 mmol/L)时增加了1.6倍(P < 0.05).提示小鼠胰腺导管上皮细胞在体外培养条件下可增殖,并具有干细胞潜能,可转分化胰岛素分泌细胞.     

原发性青光眼患者双侧视放射及视皮质的磁化传递成像

目的 应用磁化传递成像(MTI)研究原发性青光眼患者双侧视放射、视皮质的异常,探讨青光眼性损伤对后视路的影响.方法 选取20例常规颅脑MR检查无异常的原发性青光眼患者(青光眼组)及31名正常志愿者(对照组)行MTI检查,采用扰相梯度回波序列(SPGR)成像,分别于施加磁化传递饱和脉冲前后进行扫描.将扫描图像进行后处理分析,测量双侧视放射及视皮质的磁化传递率(MTR).组间各部位MTR值的比较采用两样本t检验(方差不齐则采用Satterthwaite近似t检验).结果 青光眼组左、右两侧视放射的MTR值分别为(32.8±2.2)％、(32.7±2.0)％,对照组相应部位MTR值分别为(34.6±1.4)％、(34.8±1.3)％,青光眼组低于对照组,差异有统计学意义(左侧t=3.284,右侧t=4.040;P值均＜0.01).青光眼组左、右两侧视皮质的MTR值分别为(30.1±2.0)％、(30.8±1.8)％,对照组相应部位MTR值分别为(32.3±1.2)％、(32.4±1.2)％,青光眼组低于对照组,差异也有统计学意义(左侧t =4.319,右侧t=3.445;P值均＜0.01).结论 青光眼患者后视路发生了潜在神经病理学变化,提示青光眼是累及全视路的病变.MTI能在肉眼可见的影像学改变之前提供微观病理方面的信息,是活体人青光眼视觉通路跨突触损害研究的有用方法,也为青光眼临床诊治及评估预后提供了新的思路.     

叉头状转录因子O1基因过表达慢病毒载体构建及其大鼠系膜细胞株的建立

目的构建含组成性激活突变型Fox O(CA-Fox O1 1)基因的过表达慢病毒载体,并建立其过表达的大鼠肾小球系膜细胞株。方法通过四质粒合成法构建包含CA-Fox O1编码序列的过表达慢病毒载体(LV-CA-Fox O1)。实验分为3组:空白对照组(NC组)、空慢病毒载体阴性对照组(LV-empty-Fox O1组)和过表达慢病毒载体组(LV-CA-Fox O1组)。培养系膜细胞(RMCs)72 h后,用流式细胞仪检测RMCs中绿色荧光蛋白(GFP)阳性率,并采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测Fox O1的m RNA及蛋白表达情况。结果成功构建LV-CA-Fox O1,其病毒滴度为1×108TU/ml。LV-empty-Fox O1组和LV-CA-Fox O1组GFP阳性率分别为84.5%和81.4%;与NC组相比,LV-CA-Fox O1组Fox O1的m RNA与蛋白表达量相当于NC组的27.92倍与5.41倍(均P<0.05);而NC组与LV-empty-Fox O1组Fox O1的m RNA及蛋白表达量差异均无统计学意义。结论成功构建了大鼠Fox O1基因的过表达慢病毒载体,并建立了稳定过表达Fox O1的大鼠肾小球系膜细胞株,为进一步研究Fox O1的功能和作用机制奠定了研究基础。