柯萨奇B病毒性脑膜炎262例流行病学调查和临床分析

目的 调查和分析2001年5月至8月间位于徐州市及周边地区发生的流行性无菌性脑膜炎的病因和临床表现。方法 对262名住院患者进行了问卷调查和病例分析，同时对患者的脑脊液和血清标本分别进行树萨奇病毒B、埃可病毒、乙脑病毒和腺病毒PCR和免疫荧光测定。结果 75例脑脊液标本中有39份呈现柯萨奇病毒BPCR反应阳性，阳性率达52%；69.8%患者血清柯萨奇病毒B抗原抗体免疫反应阳性。发病年龄从生后28天至14岁，大部分患者年龄在3-14岁。头痛的发生率为20%，10%患者畏光，40%患者有呕吐症状，发热占情恢复良好。结论 患者的临床症状和实验室检查符合病毒性脑膜炎的诊断标准。此次病毒性脑膜为暴发流行的病因是柯萨奇病毒B，传播方式推测与柯萨奇病毒B的呼吸道传播有关。     

Adenovirus-mediated human β-nerve growth factor gene transfer has a protective effect on cochlear spiral ganglion after blast exposure

Objective：To study whether adenovirus-mediated human β-nerve growth factor （Ad-hNGFβ） gene has any protective effect on blast hearing impairment. Methods：Deafness was induced by blast exposure （172.0 dB） in 30 healthy guinea pigs. On day 7 of blast exposure, Ad-hNGFβ was infused into the perilymphatic space of 20 animals as the study group （hNGFβ group）, and artificial perilymph fluid （APF） was infused into the perilymphatic space of the other 10 animals as the control group. At weeks 1, 4 and 8 after blast exposure, the animals were sacrificed and the cochleae were removed for immunohistochemical and HE stainings. Results： Expression of Ad-hNGFβ protein was detected in each turn of the cochlea at the 1st week, with almost equal intensity in all turns. At the 4th week, the reactive intensity of the expression of Ad-hNGFβ protein decreased. At the 8th week, no expression was detectable. The results of HE staining showed that the amount of spiral ganglions in hNGFβ group was significantly greater than that of the control group at week 4 （P〈0.01）. Conclusion： Ad-hNGFβ can be expressed at a high level and for a relatively long period in the blast impaired cochlea, suggesting that Ad-hNGFβ has a protective effect on cochlear spiral ganglion cells after blast exposure and the efficient gene transfer into cochlea had been achieved without toxicity.     

大鼠CD4+ CD25+ T调节细胞的分离培养及其功能分析

目的:研究大鼠CD4 CD25 T调节细胞(Tr)的分离培养,并对其功能进行初步分析。方法:无菌条件下切取大鼠脾脏分离脾淋巴细胞。用免疫磁珠细胞分离系统(MACS)分选CD4 CD25 T细胞,并以流式细胞术检测其纯度后,对其进行扩增。采用混合淋巴细胞反应研究CD4 CD25 Tr细胞对CD4 CD25-T细胞的免疫抑制作用。用ELISA法检测培养上清中IL-2、IFN-γ及IL-10水平的差异。结果:MACS分离的CD4 CD25 T细胞的纯度达86%~93%。该细胞与CD4 CD25-T细胞相比能特异性地表达Foxp3基因。体外培养中能明显抑制效应T细胞增殖及其分泌IFN-γ、IL-2,但其自身能分泌Th2型细胞因子IL-10。结论:采用MACS系统阴性加阳性分选,可高效快速的获得理想纯度和免疫抑制功能的大鼠CD4 CD25 T调节细胞,该细胞对CD4 CD25-T细胞具有明显的免疫抑制作用,并能特异性的表达Foxp3基因。     

链脲佐菌素诱导的糖尿病早期小鼠胸主动脉钾通道变化

目的:探讨链脲佐菌素诱导的糖尿病早期小鼠胸主动脉钾通道的变化。方法:实验采用离体血管的方法测定糖尿病鼠和正常鼠胸主动脉环对血管收缩剂:60mmol/LKCl和苯肾上腺素(PE)、内皮非依赖性舒张剂:硝普钠(SNP)以及电压依赖性钾通道(K_V通道),钙激活型钾通道(K_Ca通道),ATP敏感钾通道(K_ATP通道)阻断剂的反应。结果:糖尿病鼠胸主动脉环对60mmol/LKCl、PE和SNP的效应都显著大于对照组;K_Ca通道阻断剂四乙铵(TEA)显著降低糖尿病小鼠胸主动脉环在PE的激动下SNP的舒张效应,而且其-logIC₅₀的差值较对照组显著增大;K_V通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)显著降低糖尿病和正常小鼠胸主动脉环对SNP的舒张效应,但是-logIC₅₀差值无显著差异;K_ATP通道阻断剂格列苯脲(Glibenclamide)显著降低糖尿病小鼠胸主动脉环对SNP的舒张效应,而对照组无显著阻断作用,-logIC₅₀的差值也无显著差异。结论:糖尿病早期小鼠胸主动脉平滑肌细胞K_Ca通道的开放或表达显著增强,也证实了K_ATP通道开放增强。     

基因芯片技术检测鉴定临床常见致病真菌的初步研究

目的为了快速、简便、高通量地鉴定临床常见致病真菌,建立了一种采用基因芯片技术对临床常见的致病真菌鉴定的分子生物学方法。方法以5.8S rDNA与28S rDNA间的内转录间区2(internal transcribed spacer-2,ITS-2)为靶标,针对待检的临床常见致病真菌设计合成一系列寡核苷酸探针,制成寡核苷酸芯片。待检真菌DNA经通用引物扩增标记后,与芯片杂交,对杂交图谱分析归纳,得到一套种特异性的典型杂交图谱。待检的样品菌与基因芯片杂交,得到的杂交结果与典型图谱比对即可判断出样品的种类。结果以涉及8个属20个种的标准致病真菌菌株对芯片的特异性、重复性、灵敏度进行考察,结果表明,该研究建立的基因芯片技术可以有效地区分20种临床常见致病真菌,特异性良好,重复性良好(信噪比CV<10%),灵敏度为15 pg/ml真菌DNA。收集从临床分离的84株致病真菌菌株对基因芯片进行试用,结果显示基因芯片的鉴定结果与常规鉴定方法的鉴定结果一致。结论这项技术的建立可以稳定、特异性地实现临床常见致病真菌的高通量鉴定,为进一步检测研究奠定了基础。     

抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。     

Gadd45β和Gadd45γ在亚砷酸钠所致的MIHA细胞周期改变中的作用

目的 探索Gadd45β和Gadd45γ在亚砷酸钠所致的MIHA细胞周期改变中的作用,为砷中毒的人群防治提供依据。方法 收集贵州省兴仁县雨樟镇交乐病区砷中毒人群以及格沙屯正常人群分别作为砷中毒组和对照组,实时荧光定量PCR检测各组人群Gadd45β和Gadd45γ基因mRNA表达水平。同时,分别以不同剂量亚砷酸钠、不同时间处理MIHA细胞,流式细胞术测定细胞周期改变情况,实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测Gadd45β和Gadd45γ基因mRNA表达水平和蛋白表达情况。在上述实验基础上,针对Gadd45β和Gadd45γ基因分别设计的siRNA作用于染砷的MIHA细胞,反向验证Gadd45β和Gadd45γ基因在砷致细胞周期改变过程中的影响。统计学分析采用独立样本t检验比较两组间差异,采用单因素方差比较多组间差异。结果 人群实验研究发现,与对照组相比,砷中毒患者Gadd45β和Gadd45γ基因mRNA表达水平升高（t = 2.576,P = 0.011;t = 2.312,P = 0.022）;MIHA细胞中,随亚砷酸钠染毒剂量、染毒时间增加,细胞G2/M期比例明显升高（F剂量 = 340.136,P＜0.001;F时间 = 49.194,P＜0.001）;在相对较低亚砷酸钠浓度（低于20 μmol/L）、一定时间内（低于48 h）Gadd45β和Gadd45γ基因mRNA和蛋白表达水平随染砷剂量、染砷时间升高而升高,超过该浓度范围和作用时间后,出现表达下降的现象（Gadd45β:F剂量-蛋白 = 37.568,P＜0.001;F剂量- mRNA = 9.771,P＜0.001;F时间-蛋白 = 61.144,P＜0.001;F时间- mRNA = 46.366,P = 0.001;Gadd45γ:F剂量-蛋白 = 12.989,P = 0.001;F剂量- mRNA = 23.613,P＜0.001;F时间-蛋白 = 27.425,P＜0.001;F时间- mRNA = 37.969,P＜0.001）。转染siRNA分别下调Gadd45β和Gadd45γ的表达后,细胞周期都出现G2/M期比例下调（t = 3.053,P = 0.038;t = 14.47,P＜0.001）。结论 砷致Gadd45β和Gadd45γ基因表达水平升高在其诱导MIHA细胞出现G2/M期阻滞过程中发挥重要作用。     

实时荧光RT-PCR法和NASBA方法在呼吸道多病原检测中的应用评价

目的 评价实时荧光RT-PCR和核酸依赖性序列扩增法（NASBA）两种方法在呼吸道多病原检测中的应用价值。方法 收集北京地区急性呼吸道感染病例标本140份,分别采用实时荧光RT-PCR方法和NASBA方法对样本进行平行检测并对两种方法的病原检出限、重复性、检测一致性及检测时间等指标进行比较。结果 两种检测方法批内重复CV值均<5%,重复性较好;实时荧光RT-PCR方法对脊灰毒株核酸和H1N1病毒核酸最低检出限分别为5.62 CCID50 /0.1 ml（107 倍稀释）和10³倍稀释度,NASBA方法最低检出限分别为56.2 CCID50 /0.1 ml（106 倍稀释）和10²倍稀释。实时荧光RT-PCR灵敏度略优于NASBA方法。针对两种方法共同检测呼吸道病原体种类,实时荧光RT-PCR和NASBA方法检测阳性率分别为89.28%（125/140）、70%（98/140）。两种方法对甲型H1N1病毒、肠道病毒及新型冠状病毒的检测结果一致性达100%,对甲型流感病毒、甲型H3N2、副流感病毒1-4型的检测结果基本一致, Kappa 值范围为0.81~1;对冠状病毒229E/HKU1/OC43/NL63、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和乙型流感病毒的检测结果一致性较好, Kappa 值范围为0.61~0.80;对人偏肺病毒的检测结果一致性差, Kappa 值仅为0.55。实时荧光RT-PCR方法检测时间为90 min,NASBA方法仅需40 min即可完成。 结论 实时荧光RT-PCR方法灵敏度较高,适合对大批量临床样本进行筛查;NASBA方法检测时间短,不易污染,适用于时限性强但对灵敏度要求不太高的应用场景,如临床上重症呼吸道感染者的快速检测。建议根据不同需求和应用场景,选择合适的检测方法和产品。     

微波体模

用水、盐,聚氯乙烯粉和羧甲基纤维钠四种材料配制成一种适用的微波体模(模拟肌肉组织)。该体模的复介电系数在300～2500MHz范围内与实际人体肌肉组织的误差≤5％。这种体模的优点是材料立足国内,价廉,室温下配制,使用方便。本文也给出这种体模的温度特性,稳定性和热学特性,供电磁场生物效应和微波热疗等研究使用。     

小儿危重症血中胃泌素、胃动素水平变化研究

目的　 了解不同程度危重症患儿血中胃泌素 (GAS)、胃动素 (MTL)水平变化 ,探讨其与胃肠功能障碍或衰竭的关系。 方法 　采用放射免疫法测定不同程度危重症患儿血清GAS、血浆MTL水平 ,并以正常小儿作对照。 结果 　血清GAS、血浆MTL各组均数差异有显著性 (F =9 5 5 ,P <0 0 1;F =2 0 13,P <0 0 1) ,不同危重程度组患儿血清GAS、血浆MTL水平的升降变化差异有显著性 (P <0 0 1)。胃肠功能障碍组和衰竭组患儿血清GAS和血浆MTL水平升降变化与正常对照组及非胃肠功能障碍组比较差异有显著性 (F =11 2 0 ,P <0 0 1;F =5 3 99,P <0 0 1)。 结论 　小儿危重症时GAS、MTL参与了危重症发生、发展的病理生理过程 ,是其发生、发展的重要病理生理基础之一 ,且与胃肠功能障碍或衰竭及多器官功能衰竭 (MOF)发生有关