低氧诱导胰腺癌细胞通过外泌体途径分泌高迁移率族蛋白1

目的: 研究低氧诱导条件下胰腺癌细胞中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)的分泌途径。方法: 经GEO和TCGA数据库分析HMGB1在胰腺癌样本中的表达;低氧处理胰腺癌PaTu8988细胞0,6,12,24,48 h,免疫印迹法检测培养上清液中HMGB1的含量;采用外泌体提取试剂盒分离常氧和低氧培养液中的外泌体,运用透射电镜观察外泌体膜结构,运用免疫印迹法检测外泌体中的HMGB1以及外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81以及HSP70的表达;利用免疫荧光法和激光扫描共聚焦显微镜观察HMGB1在PaTu8988细胞中的定位情况。结果： 数据库分析结果表明,与健康胰腺组织相比,HMGB1在胰腺癌组织中呈高表达(P<0.01),且高表达者生存期明显短于低表达者(P<0.05)。低氧处理48 h,细胞培养上清液中的HMGB1含量最多,明显高于6,12,24 h。透射电镜观察到培养上清液中有微囊泡结构,直径在100 nm左右,蛋白质免疫印迹法检测到外泌体膜标志蛋白CD9,CD63,CD81,HSP70的表达和外泌体中HMGB1的表达。免疫荧光结果显示,低氧情况下HMGB1和外泌体共定位增多。 结论： 低氧处理条件下,胰腺癌细胞中HMGB1可通过外泌体途径释放到细胞外。     

干扰Hmgb3表达对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的 构建针对Hmgb3的shRNA诱导型慢病毒,检测诱导稳定感染细胞株干扰序列的干扰效率及其对A549细胞增殖的影响。方法 设计Hmgb3 及对照GFP shRNA序列,装入Tet-pLKO-puro质粒,进行慢病毒包装,感染A549细胞,嘌呤霉素筛选稳定株,筛选最佳诱导浓度并诱导干扰序列表达, Western blot检测干扰效率,MTT实验检测其对A549细胞增殖的影响。结果 构建的Hmgb3shRNA慢病毒稳定细胞株诱导后可显著抑制Hmgb3的表达,干扰效率达73%（P<0.05）,而对照组无明显干扰效果（P=0.721）,对照组的增殖率为94%,实验组的增殖率下降为46%（P<0.05）。结论 成功构建了针对Hmgb3的shRNA诱导型慢病毒,并有效沉默A549细胞靶基因,干扰Hmgb3对肺癌细胞的增殖有一定的抑制作用。     

长链非编码RNA aHIF和ANRIL在胃癌中的表达

［摘要］目的: 探讨长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)中的反义缺氧诱导因子(antisense hypoxia inducible factor,aHIF)和位于细胞周期激酶抑制因子4(INK4)基因座中反义非编码RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus,ANRIL)在胃癌组织与血浆中的表达。方法: 收集20例胃癌患者癌组织及对应的癌旁组织、33例胃癌患者和20例健康者血浆,采用实时荧光定量PCR测定胃癌组织和血浆中lncRNA aHIF和ANRIL的表达水平,分析lncRNA aHIF、ANRIL在血浆中的表达与胃癌组织表达的相关性。结果： 胃癌组织中lncRNA aHIF和ANRIL的表达水平均明显高于癌旁组织(t分别为-4.463,-4.886,P均<0.01);胃癌患者血浆中lncRNA aHIF和ANRIL的表达水平均明显高于健康者(t分别为-4.232,-4.450,P<0.01),且与胃癌组织中的表达水平呈正相关(r分别为0.536,0.524,P<0.05)。结论： lncRNA aHIF和ANRIL在胃癌组织和患者血浆中均高表达,且血浆与组织中的表达水平呈正相关。     

透明质酸功能化三氧化二钆纳米颗粒的制备及其放疗增敏作用

［摘要］目的: 制备透明质酸功能化三氧化二钆（HA Gd2O3）纳米颗粒,探讨其对肝癌HepG 2细胞的放疗增敏作用。方法: 利用透明质酸、氯化钆为前驱物通过聚醇水热法制备HA Gd2O3;通过透射电子显微镜、X射线衍射仪表征HA Gd2O3的理化特性;通过CCK 8法观察不同浓度的HA Gd2O3（0～200 mg/L）作用24 h后肝癌细胞的细胞活性;通过HE染色分析HA Gd2O3静注后小鼠各脏器病理学结构的变化;根据实验要求将细胞随机分为对照组、HA Gd2O3组、照射组、HA Gd2O3+照射组,通过CCK 8法、克隆形成实验检测HA Gd2O3的放疗增敏作用。结果： 成功构建HA Gd2O3;HA Gd2O3粒径约112 nm,物相结构无定形;0,25,50,100以及200 mg/L的HA Gd2O3对HepG 2细胞的增殖抑制率分别为0%,(0.640±0.024)%,（3.943±0.063）%,(4.871±0.062)%和（4.084±0.076）%,各浓度间抑制率差异无统计学意义（P<0.05）;静注HA Gd2O3后,小鼠各重要脏器组织形态未见明显变化;HA Gd2O3+照射组HepG 2细胞抑制率明显低于对照组、放射组、HA Gd2O3组（P<0.05）。结论： 利用透明质酸修饰成功构建HA Gd2O3纳米颗粒,其具有良好的水溶性、生物相容性,对HepG 2细胞具有显著放疗增敏作用。     

脉络丛 Neuro-2A细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突的排斥作用

目的:探讨脉络丛组织、Neuro-2A细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突生长的影响。方法:采用ECM Gel作为组织培养的基质底物,将脉络丛组织或者Neuro-2A细胞株和胚胎12天的腹侧脊髓运动神经柱进行三维共培养,观察脉络丛组织或者Neuro-2A细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突生长的影响。结果:脉络丛组织或者Neuro-2A细胞株与胚胎12天的腹侧脊髓组织共培养2天后,脊髓运动神经元轴突表现为偏离脉络丛组织或者Neuro-2A细胞株的偏向性生长。结论:脉络丛组织和Neuro-2A细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突有排斥作用。     

重组腺病毒载体介导人LASS2基因在肝癌细胞转移中的抑制作用

目的:探讨人源性长寿保障基因(homo-sapiens longevity assurance homologue 2 of yeast LAG1,LASS2)对人肝癌HCCLM3细胞体外转移的影响及可能的作用机制.方法:构建含人LASS2基因的重组腺病毒并转染入HCCLM3细胞;采用蛋白质印迹法检测HCCLM3细胞中LASS2蛋白的表达水平;划痕实验及体外侵袭实验检测LASS2基因过表达对HCCLM3细胞在迁移和侵袭等转移能力上的改变;免疫共沉淀法验证LASS2蛋白与V-ATPase(vacuolar H+-ATPase)质子泵中的c亚基(ATP6L)在细胞内相互结合的情况;通过对细胞内外H+浓度的测定,探讨LASS2过表达对V-ATPase功能抑制的情况.结果:成功构建了含人LASS2基因的重组腺病毒,LASS2基因在HCCLM3细胞中能有效表达;LASS2过表达可使HCCLM3细胞的侵袭和迁移能力均明显下降(P＜0.01),其中侵袭能力下降达(48.3±7.6)％,穿过划痕的细胞个数从对照组的(59.00±6.87)个下降至(10.83±3.75)个;LASS2蛋白与ATP6L蛋白在HCCLM3细胞内特异性结合;LASS2过表达后,细胞内外H+浓度发生明显变化,表明V-ATPase质子泵功能受到抑制.结论:LASS2基因在HCCLM3细胞中过表达可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与LASS2蛋白结合ATP6L,抑制其分泌H+功能相关.     

靶向Lin28B基因沉默对胰腺癌细胞增殖的影响

目的 探讨靶向Lin28B基因沉默对细胞增殖的影响.方法 设计Lin28B及GFP短发夹核糖核酸(shRNA)序列,装入Tet-on-pLKO-puro质粒,进行慢病毒包装,感染胰腺癌细胞Panc1,嘌呤霉素筛选并培养稳定干扰细胞株.实验组为Panc1-Tet-on-pLKO-sh-Lin28B;对照组为Panc1-Tet-on-pLKO-sh-GFP.筛选强力霉素最佳诱导浓度并诱导干扰序列表达,Western blot检测干扰效率,细胞增殖与活性实验CCK8检测沉默Lin28B对Panc1细胞增殖的影响.结果 构建的Tet-on-pLKO-sh-Lin28B慢病毒可显著抑制Panc1细胞内Lin28B的表达.与对照组Panc1-Tet-on-pLKO-sh-GFP相比,实验组Panc1-Tet-on-pLKO-sh-Lin28B的增殖速度减缓(P＜0.05).结论 成功筛选出沉默Lin28B的稳定干扰细胞株,沉默Lin28B对胰腺癌细胞的增殖有抑制作用,为进一步研究Lin28B基因的功能或基因治疗提供有用技术.     

神经生长因子及其受体在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达及其生物学意义

目的：观察神经生长因子在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达．分布及其生物学作用。 方法：实验于2005—07／12在江苏大学医学院基础与临床研究中心完成。①U251培养3d后，于培养基中加入终浓度为2mmol／L羟基脲继续培养24h（≥1个细胞周期），使细胞同步化于DNA合成期。②用免疫荧光法对细胞内神经生长因子及其高亲和力受体酪氨酸蛋白激酶受体A进行染色定位：③免疫印迹法检测U251培养上清液中的神经营养因子表达。④促胚胎脊髓神经细胞生长试验鉴定U251细胞培养上清液的神经营养因子活性。取怀孕16d的SD大鼠1只，断头处死，浸泡体积分数为0．75的乙醇20min后剖腹取胎鼠，分离脊髓组织，细胞培养2d后，分别加入无血清DMEM（对照组）及培养过U25124h的无血清DMEM（实验组）。 结果：①神经生长因子及酪氨酸蛋白激酶受体A在U251中高表达，神经生长因子主要呈颗粒状分布于胞浆及胞核内，酪氨酸蛋白激酶受体A分布于胞膜及核仁部位。②U251无血清培养上清液能够促进胚胎脊髓神经细胞集落的形成，实验组集落数明显多于对照组（345．38&;#177;14．15），（145．5&;#177;12．71）／孔，P〈0．01）；且在浓缩的U251无血清培养上清液中检测出相对分子质量为36000的神经生长因子肽链。 结论：人脑胶质瘤细胞株U251呈神经生长因子及酪氨酸蛋白激酶受体A强阳性表达，且能合成并分泌具有生物学活性的神经营养因子，相对分子质量为36000的神经生长因子是其中主要成分之一。     

神经生长因子对受体pTrkA 在U251细胞中亚定位的影响

目的：探讨神经生长因子（NGF）对其活化的受体pTrkA在U251细胞中不同运输泡分布的影响。方法：U251细胞无血清培养24h后,用含NGF（100ng／mi）的DMEM继续培养细胞,分不同时相固定细胞,用免疫荧光技术标记共标记pTrkA和相关运输泡的标志蛋白,在激光共聚焦显微镜下观察pTrkA在相关运输泡中的定位情况。结果：NGF处理5min后,大量pTrkA出现在EEA1（标记早期内体）标记的运输泡中;15min后,分别出现在mR（标记溶酶体）标记运输泡中;45min后,pTrkA大量积聚在核周,与NUP358共定位。而未处理NGF对照组细胞内pTrkA表现为弱阳性。结论：NGF能促进TrkA活化、内化和在内体中的分选过程,并可能涉及pTrkA的核转位过程。     

基础医学整合课程体系构建与学生评价

目的:分析临床医学本科专业基础医学整合课程体系的建设方案和成效,为培养高素质医学人才提供理论参考.方法:通过专家反复论证制定基础医学整合课程方案,方案实施后,采取便利抽样法选取临床医学专业300名本科生进行纸质问卷调查.结果:问卷调查发现已完成基础医学相关课程学习的286名本科生中90％对基础医学整合课程体系有一定程度...