结核分枝杆菌mRNA在利福平快速药敏试验中的初步应用

目的　建立一种Mycobacteriumtuberculosis(结核分枝杆菌 ,MTB)mRNA快速敏感的检测方法并初步探讨其在利福平快速药敏试验中的应用。方法　用超声粉碎和Tripure试剂提取MTB总RNA ,针对α抗原 85B的特定编码序列建立MTBmRNA的RT PCR检测方法 ;观察MTB在含 1、2、4 μg/ml利福平的液体培养基中生长时 ,85BmRNA的动态改变 ,确定快速检测利福平耐药菌株的最佳药物浓度和时间点 ,比较RT PCR和快速培养法对 2 0株临床分离菌株利福平耐药性检测的差异性。结果　 85BmRNA的RT PCR最低检测下限为 10 0 0个细菌。 85BmRNA的动态结果表明 ,在 4 μg/ml利福平中培养 2 4h为最佳药物浓度和时间点。RT PCR和快速培养法对 2 0株临床菌株利福平药敏试验检测结果无显著差异 (χ2 =0 .5 ,P >0 .0 5 ) ,但前者能显著缩短药敏检测周期。结论　检测结核分枝杆菌mRNA的RT PCR方法可望应用于利福平快速药敏试验     

γδT细胞及其亚群在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的探讨γδT细胞及其主要亚群在卵巢癌患者肿瘤组织中的表达及其与卵巢癌患者临床病理特征间的关系。方法流式细胞术检测15例卵巢癌组织、10例卵巢良性肿瘤组织和4例正常卵巢新鲜组织中γδT、Vδ1 T、Vδ2 T细胞比例;免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测上皮性卵巢癌(40例)、卵巢交界性肿瘤(20例)和卵巢良性肿瘤(20例)组织切片中γδT、Vδ1 T细胞的表达,比较卵巢癌样本中阳性表达细胞数与患者年龄、肿瘤体积、病理类型、FIGO分期、组织学分化和淋巴结转移的关系。结果卵巢癌组织γδT、Vδ1 T细胞的比例显著高于卵巢良性肿瘤组织(P0.01)和正常卵巢组织(P0.01);Vδ2 T细胞在卵巢良性肿瘤组织浸润比例高于卵巢癌组织(P0.01);免疫组化染色发现卵巢癌组织中γδT、Vδ1 T细胞数量显著高于卵巢交界性肿瘤组织(P0.01)和卵巢良性肿瘤组织(P0.01);卵巢癌组织中γδT、Vδ1 T细胞数与患者FIGO分期和淋巴结转移均有统计学关系(P0.05);另外,卵巢癌中γδT细胞数与肿瘤体积具有统计学关系(P0.05)。结论卵巢癌组织中具有较高水平的γδT细胞,尤其是亚群Vδ1 T细胞,可能与卵巢癌患者疾病临床进展有重要联系。     

荧光定量PCR检测鼻咽部脱落细胞内EBV-DNA

目的 建立荧光定量PCR（FQ－PCR）检测鼻咽部脱落细胞中EBV－DNA的方法。方法 以患者鼻咽部脱落细胞内DNA作为样本，以EB病毒基因序列中EBNA1（核抗原1）基因片段作为扩增的靶DNA，同时从人β－珠蛋白DNA片段作为内参照，合成了两对引物，并设计了两个特异的荧光探针，优化了FQ－PCR反应体系，同时对这两个片段进行扩增，每一标本得到两个Ct值；CtE和Ctβ，得到单位细胞EB病毒的相对量。结果 临床标本29例中，阳性22例，阴性7例，临床资料证实阳性者全部为鼻咽癌（NPC），阴性者全部为非鼻咽癌。结论 建立的FQ－PCR检测鼻咽部脱落细胞中EBV－DNA的方法，能反映单位细胞病毒的复制情况，可用于NPC的筛查，并可能应用于该病的风险评估和疗效观察。     

Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA

目的 采用一种新的铕螯合物BHHCT，制备高灵敏度荧光标记物，建立检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA的方法。方法 采用柱层析纯化的方法抽提血清中HCV RNA。以5′端带有生物素的引物进行RT－PCR Tth酶一步法扩增，通过固定于微孔板上的捕获探针与带有生物素的PCR扩增产物杂交后，利用标记有铕的链霉亲合素与生物素的特异性结合，将铕连接到待测核酸上，在特定波长的激光光激发下发出荧光，进行检测。结果 铕标记检测法与酶标法的变异系数、敏感性、特异性分别为10．43％、100％，100％与16．25％，94％，100％。结论 Eu标记RT－PCR Tth酶一步法检测HCV RNA，具有敏感、特异、快速、重复性好、不受环境因素影响和无溴乙锭污染等优点，可望取代酶标法及电泳法。     

4种血浆游离DNA提取方法的比较

目的比较4种方法对血浆游离结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA和质粒DNA的提取效率。方法MTBDNA和重组质粒DNA经紫外分光光度法准确定量并梯度稀释,建立标准品。构建含有一定浓度MTBDNA和质粒DNA的血浆,分别采用4种方法提取血浆游离DNA,采用实时荧光PCR技术定量检测模拟血浆中MTBDNA和质粒DNA的含量,比较各种方法的提取效率。结果4种方法中,磁珠法对MTBDNA和质粒DNA的提取效率最高,分别为52.8%和69.2%;相对丢失率最低,分别为40.1%和31.8%;重复性最好,其变异系数分别为26.7%和26.0%。结论在4种方法中,磁珠法对血浆游离DNA的提取效率最高,尤其适合于小片段DNA的提取。     

慢性乙型肝炎患者血清中HBeAg、HBsAg与HBV-DNA的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清中HBeAg、HBsAg与乙肝病毒HBV-DNA之间的关系。方法选取655例HBsAg阳性的慢性乙型肝炎患者血清标本,用微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBeAg、HBsAg,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HBV-DNA。结果在HBeAg阳性标本中,HBV-DNA阳性率为64.64%;HBeAg阴性标本中,HBV-DNA阳性率为36.61%,二者差异有统计学意义(P0.01)。不同浓度组HBeAg和HBV-DNA检测结果比较,差异有统计学意义(P0.01)。不同载量HBV-DNA组,HBeAg差异有统计学意义(P0.01),且随HBV-DNA含量增加而增加;HBsAg差异也有统计学意义(P0.01),但随HBV-DNA含量增加而降低。结论同时检测HBV-DNA与HBeAg能更好地用于临床诊断与疗效观察,HBeAg随着HBV-DNA拷贝数的增加而增加,而HBsAg却呈下降趋势。     

血浆DNA定量用于重症肝炎患者肝细胞损伤评估

目的定量重症肝炎患者血浆DNA的水平,与ALT比较,评估鉴别重症肝炎的临床应用价值。方法收集30例重症肝炎患者外周血标本6ml,以急性肝炎(20例)、慢性乙肝(90例)、肝硬化(45例)和健康体检者(100例)作为对照。用磁珠法提取血浆DNA,双重实时荧光定量PCR测定血浆DNA。结果乙型肝炎患者的血浆DNA水平(中位数)显著高于健康对照(104.2ng/mlvs.23.4ng/ml,P=0.0000)。血浆DNA水平在重症肝炎患者和急性肝炎、慢性乙肝及肝硬化患者之间都具有显著性差异(P=0.0018、0.0000和0.0000)。乙型肝炎患者的血清ALT水平(中位数)显著高于健康对照(107.5U/Lvs.24.1U/L,P=0.0000)。重症肝炎患者的血清ALT水平与急性肝炎之间有显著差异(P=0.0024),但与慢性乙肝和肝硬化之间没有差异(P=0.0600和1.0000)。ROC曲线分析显示,在鉴别重症肝炎和肝硬化以及慢性乙肝时,血浆DNA的鉴别能力显著优于血清ALT(AUC,0.95vs.0.51,P=0.0000;0.86vs.0.34,P=0.0000)。结论用双重荧光定量PCR检测血浆DNA...     

基于PBL教学的临床微生物检验课程新型考核体系的构建与实践

近年来,PBL教学已逐步应用于医学教育。南京医科大学医学检验系自2007年起在临床微生物检验课程中进行了PBL教学的尝试和探索,并进一步建立了基于PBL教学的新型考核体系,从PBL教学考核、理论考核和实验考核三个方面多层次地考核学生的学习能力和学习效果。本文介绍了临床微生物检验课程中应用该新型考核体系的具体方法、应用体会,以及实施过程中存在的问题和思考。     

医学检验学实验考试改革的体会

考试改革是高等教育教学改革的重要方面,要以能力和素质为导向,实现知识考试向能力和素质考试的转变。经过3年的考试内容和考试方法的改革与实践,我系逐步形成了一套科学的、规范化的医学检验学实验考试体系。该体系对全面提高学生的综合能力和整体素质,推进高校教学改革,实现教学自主化、高效化具有重要的导向作用。     

卵巢癌外周血CD4+调节T细胞与TGF-β1水平的相关性研究

目的 探讨卵巢癌患者外周血中CD4₊CD25₊及CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞的表达,及其与转化生长因子β1(TGF-β1)水平的相关性。方法 采用流式细胞术检测24例上皮性卵巢癌患者外周血中CD4₊CD25₊及CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞的表达,收集每例患者对应的血浆,ELISA法检测卵巢癌患者血浆中TGF-β1浓度,并与20例卵巢良性肿瘤及20例健康体检者做比较研究。结果 与卵巢良性疾病及健康对照组相比,卵巢癌患者CD4₊CD25₊、CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞及TGF-β1的表达水平明显增高(均P<0.01);III/IV期卵巢癌患者CD4₊CD25₊、CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞及TGF-β1的表达水平明显高于I/II期患者(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示,卵巢癌患者外周血CD4₊CD25₊及CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞水平与血浆TGF-β1水平均呈现正相关关系(r=0.656, P < 0.05; r=0. 574, P < 0.05)。结论 卵巢癌患者外周血高表达CD4₊调节T细胞,且与血浆TGF-β1呈正相关。检测外周血CD4₊调节T细胞与TGF-β1水平对于判断卵巢癌病期有重要意义。TGF-β1水平增高可能参与调节CD4₊调节T细胞对卵巢癌机体的免疫负调节机制。