单核巨噬细胞抗原-1阳性细胞在大鼠肾小球硬化中的表达

目的检测单核巨噬细胞抗原（ED）-1在大鼠局灶节段肾小球硬化（FSGS）中的表达,探讨单核巨噬细胞浸润在FsGS发生发展中的作用。方法12只雄性Wistar大鼠,实验组7只,一次性静脉注射氨基核苷嘌呤霉素9mg／100g体重,对照组5只,静脉注射生理盐水一次,动态观察尿蛋白定量变化。第20周末宰杀,检测血浆白蛋白、血脂、肾功能。肾脏制备病理标本。应用免疫组织化学法观察两组大鼠肾组织中纤维连接蛋白（FN）和EDI阳性单核巨噬细胞的表达,计数ED1阳性细胞数,分析其与尿蛋白程度及FN表达的相关性。结果FSGS模型组大鼠用药后尿蛋白定量显著增高,血总胆固醇显著增高。肾脏病理示部分肾小球局灶节段硬化或全球性硬化,细胞外基质节段性增多。在模型组大鼠肾组织中ED1阳性细胞较正常大鼠肾组织显著增多（P〈0．01）。模型组大鼠肾组织中FN的表达较正常大鼠肾组织明显增多（P〈0．05）。ED1阳性细胞数与FN表达呈直线正相关（r=0．876,P〈0．01）。ED1阳性细胞数与尿蛋白程度呈直线正相关（r=0．651,P〈0．01）。结论肾间质单核巨噬细胞浸润可以加重细胞外基质沉积,加重肾小球硬化,提示炎症反应在局灶节段肾小球硬化的发生与发展中起一定作用。     

反义细胞周期素D1基因转导肾小球系膜细胞

目的：建立外源基因转导肾小球系膜细胞的基因转移系统，为系膜增殖性肾小球疾病的机制和治疗研究提供条件。方法：利用基因重组技术构建反义Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１逆转录病毒表达载体，重组体经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染第３代包装细胞，建立了能持续分泌假病毒颗粒的无性细胞系，重组病毒经ＤＥＡＥ－葡聚糖转导肾小球系膜细胞，并对系膜细胞转录表达Ｃｙｌｉｎ Ｄ１反义ＲＮＡ水平进行原位杂交分析。结果：建立的无性细胞系上清中病     

炎症因子内皮素-1对肾小球系膜细胞周期G_1期调控蛋白表达的影响

目的：研究内皮素-1对肾小球系膜细胞周期G1期进展的调控机制。方法：应用免疫组织化学、免疫印迹分析等技术检测系膜细胞在内皮素-1刺激增殖时，细胞内G1期调控蛋白cyclinD1和cdk4表达的变化。结果：正常指数式生长的系股细胞核内表达二种蛋白，在内皮素1刺激下G1期进展中cyclinD1表达增加，cdk4表达变化不明显。结论：cyclinD1是体外培养肾小球系膜细胞针对炎症因子内皮素1刺激时G1期进展的重要调节蛋白。     

低氧诱导肌成纤维细胞生成并通过ERK1/2途径促进Ⅰ型胶原的表达

目的：探讨低氧能否激活成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,以及低氧环境对肾皮质肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）的影响及其可能的信号通路。方法：（1）采用正常大鼠肾成纤维细胞系（NRK-49F），应用Western blotting方法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达;比较低氧和正常氧条件下α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白水平。（2）原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞，Western blotting方法检测低氧和正常氧条件下，HIF-1α和Ⅰ型胶原蛋白水平以及ERK1/2的活化及其特异阻断剂 PD98059的阻断效应；RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原mRNA表达水平；细胞免疫化学法检测HIF-1α胞内表达部位的变化；明胶酶谱法检测细胞上清中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP -9）的活性。结果：（1）低氧刺激6 h，NRK-49F细胞和肌成纤维细胞胞内和核内均有HIF-1α蛋白表达，核内更明显。（2）低氧培养12 h,NRK-49F细胞表达α-SMA蛋白明显增高，是正常氧组的187%±32%（P<0.05），验证了低氧可引起成纤维细胞表型转化。（3）低氧刺激原代培养的正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞6 h、12 h上清中Ⅰ型胶原蛋白水平增加，分别为正常氧组的171%±27%（P<0.05）和256%±61% （P<0.05）；低氧刺激4 h、6 h，Ⅰ型胶原mRNA表达增加，为正常氧组的189%±28%（P<0.05）和221%±44%（P<0.05）。（4）低氧刺激肌成纤维细胞6 h、12 h、24 h，培养上清液中MMP-9、MMP-2活性无明显变化。（5）低氧刺激肌成纤维细胞15 min 即可使ERK1/2活化，阻断实验显示，PD98059可以使低氧12 h引起Ⅰ型胶原增加（低氧刺激组为正常氧对照组的273%±51%，P<0.05)显著减少（PD98059 +低氧组为正常氧组的108%±19%，P>0.05)。结论： 低氧促肾纤维化可能与其诱导肾成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并经ERK1/2途径增加Ⅰ型胶原蛋白的表达有关。     

低氧通过p38丝裂素激活蛋白激酶途径刺激人肾间质成纤维细胞表达结缔组织生长因子

目的:研究低氧条件下人肾间质成纤维细胞表达结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及其可能的信号途径,从而探讨低氧导致肾间质纤维化的分子机制.方法:以人肾间质成纤维细胞TK173作为研究对象,应用Western blot技术,检测低氧标记蛋白分子,低氧诱导因子-lα(hypoxia induced factor-lα,HIF-1α)蛋白作为低氧标记物;比较低氧(1%O2,体积分数)和正常氧(21%O2,体积分数)条件下TK173细胞培养12,24,48 h后CTGF蛋白水平;低氧刺激TK173细胞30 min,1 h,6 h和12 h,运用抗磷酸化抗体检测丝裂素激活蛋白激酶(MAPKs)活化;在低氧刺激半小时前分别加入p38、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun-N末端蛋白激酶(JNK)信号通路特异阻断剂SB203580,PD98059,SP600125,低氧培养24 h后检测细胞CTGF蛋白水平.用RT-PCR技术分析CTGF mRNA水平变化.结果:TK173细胞正常氧组仅有HIF-1α蛋白微弱表达,低氧组有高水平HIF-lα蛋白表达.在低氧条件下培养12 h后细胞CTGF蛋白增加,24 h时CTGF蛋白表达最强,是正常氧组的(2.1±0.1)倍,至48 h降至对正常氧组水平;同时低氧培养刺激CTGF mRNA表达,在1 h时开始增加,6 h时达高峰为正常氧组的(6.6±1.0)倍,24 h后恢复基础水平.低氧可以活化MAPKs,JNK在30 min达到高峰,ERK1/2、p8在刺激1 h时达高峰,6 h减弱,12 h减至基础水平;应用ERK1/2抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP00125不能减弱低氧刺激CTGF蛋白表达增加的效应,但应用P38活化抑制剂SB203580可以明显减少低氧刺激的CTGF蛋白和mRNA的增加.结论:低氧可刺激人肾间质成纤维细胞表达CTGF,并且该作用依赖p38通路的活化.