简便高效的原代HUVECs培养

 目的 建立简便高效的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）体外分离、培养、冻存方法,以获得大量HUVECs为相关医学基础研究及组织工程学提供良好细胞来源。方法 新鲜脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶消化,获得HUVECs,内皮细胞培养基(ECM)进行培养。倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学、RT-PCR检测VWF、CD144的表达。HUVECs加入10 %甘油的冻存液, 置于液氮保存4周,冻存复苏后Western blot检测VWF、CD144蛋白水平的表达。结果HUVECs体外生长2~3 d可铺满单层,细胞呈梭形,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;高表达VWF和CD144;冻存后复苏的细胞分裂增殖旺盛,蛋白水平高表达VWF、CD144。结论 脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可获取大量高纯度的内皮细胞,可作为相关研究良好的细胞来源。     

DNA聚合酶β基因表达对NIH3T3细胞增殖影响

目的 观察不同类型DNA聚合酶B(DNA Polymerase β,DNA pol β)在小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)的表达及细胞增殖特性的变化.方法 用脂质体转染的方法,将野生型(wild type,wt)和食管癌缺失突变型(delete mutional type,dmt)的pol β重组荧光载体pEGFP-C3-pol β转染NIH3T3细胞,建立稳定表达pol β的细胞系,通过荧光倒置显微镜观察其定位,四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法绘制生长曲线,流式细胞仪测定其细胞周期.结果 转染2种类型pol β的NIH3T3细胞株中,均有外源基因mRNA水平和蛋白水平的表达;荧光倒置显微镜结果显示,野生型的以细胞胞核为主,缺失突变型的pol β表达以细胞胞浆为主,从第3 d开始,缺失突变型的细胞生长速度较野生型和对照组明显增快(P<0.05);转染缺失突变型NIH3T3细胞的S期细胞比例为68.29%,明显高于野生型的57.18%、对照组的58.12%和未转染NIH3T3细胞的57.35%(P<0.05).结论 外源野生型pol β基因表达后对NIH3T3细胞的增殖速度无明显影响,而缺失突变型则使其增殖速度加快.     

不同浓度的互隔交链孢霉素对NIH／3T3细胞 cAMP水平的影响

目的 观察不同浓度的互隔交链孢霉素(ahenuene,ALT)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中cAMP水平的影响.方法 以NIH/3T3为研究对象,观察以0、2.5、5、10、15和20 μmol/L ALT作用30 min,并设0.4 mmol/L烷化剂甲璜酸甲酯(methyl methane.sulfonate,MMS)为阳性参照物,使用超声法破碎细胞,以125I标记的放射免疫分析(RIA)检测细胞内cAMP水平.结果 与对照组相比,5、10、15和20 μmol/L ALT 能升高细胞内cAMP水平(P<0.05);而以0.4 mmol/L MMS处理细胞.cAMP水平同样升高.结论 ALT对细胞具有明显的影响,可能与经由第二信使cAMP所介导的相关信号通路有关.     

实时荧光定量RT-PCR和cDNA基因芯片方法分析食管癌组织中基因的表达

目的:采用实时荧光定量RT-PCR和cDNA基因芯片2种技术分析食管癌细胞基因表达的特征。方法:应用cDNA基因芯片筛选15例食管癌基因表达谱,用实时荧光定量RT-PCR验证其中16个基因的表达变化。结果:实时荧光定量RT-PCR和cDNA基因芯片技术对16个基因的检测结果一致,不仅变化方向相同,而且表达值非常接近。结论:cDNA基因芯片和实时荧光定量RT-PCR分析基因表达变化都是可信的,基因芯片筛选基因表达谱具有高通量大规模的特点,而实时荧光定量RT-PCR则适合单个基因表达变化的研究,两者互为补充和印证。     

马钱子碱和士的宁镇痛作用的初步探讨

本文研究了中药马钱子的主要成份马钱子碱、士的宁的镇痛作用,并与哌替啶作了比较。小白鼠醋酸扭体法:①量效关系:马钱子碱、哌替啶抑制ip HAC引起的扭体半数有效量(ED_(50))分别为12.68(8.12～14.15)mg/kg;2.69(2.21～3.29)mg/kg(Litchfield-Wilcoxon-method)。士的宁与对照组无显著差异。②时效关系:马钱子碱抑制扭体作用持续时间较哌替啶为长约4倍。小白鼠热板法:马钱子碱、哌替啶在一定剂量和时限内均有明显镇痛作用,士的宁无显著镇痛作用。马钱子碱39.81(38.95～51.29)mg/kg、哌替啶41.69(38.19～45.5)mg/kg时,两药100min时限内平均镇痛阈提高百分率相等。     

激光捕获显微分离-高可信度全基因组mRNA扩增技术的建立及其在食管癌细胞基因检测中的应用

目的:建立激光捕获显微分离(LCM)-高可信度全基因组mRNA扩增(GMA)技术,并用其分析食管癌细胞基因表达的变化。方法:应用LCM直接捕获15例食管癌组织中癌细胞,提取并纯化mRNA,在T7RNA聚合酶作用下扩增成cRNA直接用于表达谱筛选。用实时荧光定量RT-PCR验证MET和PTPN2基因的表达,并将LCM与组织匀浆法和显微镜下针挑法检测结果进行比较。结果:基因芯片筛选出上调基因MET,其高表达率为12/15;下调基因PTPN2,其低表达率为9/15;2个基因实时荧光定量RT-PCR检测结果与上述结果的一致率达100%。组织匀浆法、显微镜下针挑细胞法所获样品经实时荧光定量RT-PCR检测,MET结果与LCM-GMA结果的一致率分别为25%(3/12)和33%(4/12),PTPN2分别为22%(2/9)和33%(3/9)。结论:LCM-GMA技术十分有利于基因表达谱的芯片分析和单个基因表达变化的实时荧光定量RT-PCR研究。     

各期高血压患者血液流变学改变及其相关因素的研究

本文采用系统的血液流变学研究方法,观察了245例各期高血压患者的血液流变学改变,同时观察其甲皱微循环和血脂的变化,并与116例正常人作对照。结果表明:高血压患者存在着显著的血液高粘滞状态,表现为全血粘度、血浆粘度和全血还原粘度均明显升高(P<0.001)。这种改变在高血压Ⅰ期即已存在,随着病情发展而加重。同时伴有HCT、EER及红细胞变形能力的明显异常(P<0.01)各期高血压患者均出现明显的甲皱微循环障碍,主要表现为毛细血管袢的严重畸型及其内血流速度缓慢。本结果证实了高血压病理过程中存在着血液流变学异常及微循环障碍。这种改变与病情发展有关。提示其对高血压病理过程的影响。     

小鼠内源性抗原提呈树突状细胞疫苗的抗瘤作用

目的：将pcDNA3-hCEA真核表达质粒和肿瘤来源的RNA分别转染小鼠骨髓树突状细胞（dendritic cell,DC），观察内源性抗原提DC疫苗诱导BALB／C小鼠对CT26－hCEA^ 的抗肿瘤免疫效应。方法：采用细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4诱导培养法制备小鼠骨髓DC，利用Lipofectamine将pcDNA3-hCEA和肿瘤来源的RNA分别转染DC，制备能够内源性表达CEA的DC疫苗。使用DC疫苗预防免疫BALA／C小鼠，观察其对于荷CT26－hCEA^ 小鼠的抗肿瘤效应。结果：内源性抗原提呈DC疫苗明显延长荷CT26－hCEA^ 瘤小鼠生存期；与其他方法制备的DC疫苗相比，有较强的针对性抗肿瘤免疫效应和较长的持续效应。结论:地于免疫逃逸的肿瘤，内源性抗原提呈DC疫苗更具有免疫预防效应。     

人食管癌顺铂耐药细胞系DNA聚合酶β的表达

目的:建立人食管癌顺铂(cDDP)耐药细胞系,测定耐药细胞系DNA聚合酶β(polβ)的表达。方法:以临床食管磷癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用cDDP(10mg/L)反复间歇 24h暴露法作用于食管癌细胞系ECa -109,建立cDDP耐药细胞系ECa 109 /cDDP;MTT法测定药物敏感性,倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞的周期分布,Westernblot测定细胞内DNApolβ表达水平。结果:与ECa- 109细胞比较,ECa -109 /cD DP细胞形态发生了改变,对cDDP的耐药指数为 1. 56;细胞周期发生了变化,S期细胞增多,G0 /G1 期细胞减少,细胞内DNApolβ表达水平增高(P<0. 05或 0. 01)。结论:ECa-109 /cDDP具有耐药表型,其耐药性产生可能与细胞内DNApolβ表达增高有关。     

胃肠道间质瘤免疫表型及预后分析

目的:探讨胃肠道间质瘤(GIST)的免疫表型特征及其与侵袭危险性和预后的关系.方法:采用免疫组织化学SP法检测59例GIST(良性19例,恶性19例,交界性21例)组织CD117、CD34、Vimentin、Desmin、SMA、MSA、S-100、NSE和NF的表达.38例获随访12～72个月,按Fletcher等GIST生物学行为评价标准进行侵袭危险性评估,极低度(Ⅰ)2例,低度(Ⅱ)11例,中度(Ⅲ)11例,高度(Ⅳ)14例,分析生存率与侵袭危险性的关系.结果:59例GIST中,平滑肌源性22例,神经源性22例,神经和平滑肌双源性10例,狭义GIST 5例;4类GIST CD117、CD34、Vimentin阳性率、不同恶性程度GIST上述几种免疫表型阳性率差异均无统计学意义(P>0.05).生存率随侵袭危险性增大而降低(P<0.05).结论:CD117、CD34有助于GIST的诊断.GIST侵袭危险性与预后有关.