几种改良的多聚酶链反应在丙型肝炎病毒检测中的应用

本文综述了近年来几种改良的多聚酶链反应在检测丙型肝炎病毒中的应用。包括巢式ＰＣＲ、半巢式ＰＣＲ、一步法ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、链特异性ＰＣＲ、ＲＮＡ捕获法ＰＣＲ及原位ＰＣＲ。     

乙肝DNA聚合酶在187例乙型肝炎病毒感染的各类肝病中的检测

采用免疫沉淀法对187例乙肝病毒感染患者作了DNA聚合酶(DNA--P)的测定。在各类肝炎中DNA—P的阳性检出率以慢活肝最高为66.6％,依次为急性肝炎45％,携带者33.5％,慢迁肝31.5％。本文分析了乙肝的抗原抗体系统与DNA—P检出率的关系。经统计学处理,DNA—P检出率与HBsAg滴度增高呈正相关γs=0.99,P<0.01。HBeAg阳性组DNA—P检出率为62.4％,抗—HBe阳性组DNA—P检出率为29.5％,抗—HBs阳性8例、DNA—P均为阴性。抗—HBc—IgM强阳性组DNA—P检出率为86.4％。作者认为1/3无症状携带者DNA—P活力增高表明病毒在复制,因此携带者在流行病学上的意义不可忽视。又鉴于18例抗—HBe阳性血清DNA—P活力增高,因此在判断HBeAg~-/抗—HBe~+患者病毒复制情况时,应予慎重。     

大豆糖苷修饰阳离子脂质体的体外肝细胞靶向性

目的研究肝靶向物质大豆糖苷(soybean-derived sterylglucoside,SG)的加入对阳离子脂质体肝细胞靶向性的影响。方法以荧光素钠(FS)为模型药物，采用HepG₂ 2.2.15细胞模型和SD雄性大鼠，检测SG，SG/Brij-35(卞泽-35)和SG/PEG-DSPE(polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine)修饰的阳离子脂质体的物理化学性质，在细胞培养水平和离体肝脏水平考察阳离子脂质体的转染和肝细胞选择性。结果未修饰以及SG，SG/Brij-35和SG/PEG-DSPE修饰的FS阳离子脂质体在中性溶液中的包封率分别为91.74%，88.46%，89.70%和83.12%，粒径分别为124.4，113.7，110.8和93.0 nm，空白脂质体在溶液中表面电荷为正。细胞培养和肝脏灌流结果说明，阳离子脂质体的转染率显著高于中性脂质体，SG单独修饰后的阳离子脂质体的细胞转染率较未修饰有显著提高，SG/Brij-35修饰的阳离子脂质体则表现出肝实质细胞选择性。结论阳离子脂质体可以促进FS进入肝脏细胞，具有较高的肝细胞摄取率，而SG/Brij-35的修饰可以提高脂质体的肝细胞选择性。     

不同人群丙型肝炎病毒基因分型

目的 研究不同人群丙型肝炎病毒的基因分型。方法 对141例抗HCV（ ）、60例抗HCV（-）及28例正常献血员的共132份HCV-RNA阳性血清,运用限制性片段长度多态性分析（RFLP）法作酶切分型。结果 3组人群不同基因型检出率分别是1b/Ⅱ型87.18%、100%、100%;2a/Ⅲ1.71%、0、0;两者混合型（1b/2a型）11.11%、0、0。对抗HCV（ ）血清,分为ALT正常组和异常组,2组人群不同基因型检出率分别是1b/Ⅱ型93.33%、83.33%;2a/Ⅲ型0、2.78%;两者混合型7.14%、13.89%。结论 我国不同人群中HCV感染者均以HCV1b/Ⅱ型为主,今后应以HCV1b/Ⅱ型为重点,加强HCV的诊断、治疗和疫苗研制工作。     

SNaPshot技术检测乙型肝炎病毒基因组P基因区单核苷酸多态性的研究

目的　建立SNaPshot技术对乙型肝炎病毒(HBV)基因组P基因区单核苷酸多态性(SNP)的分析。方法　针对HBVYMDD变异位置的上、下游设计引物,用PCR方法进行DNA扩增,产物直接测序或克隆测序。再针对变异位点74 1A G变异型(YVDD)和74 3G T变异型(YIDD)的紧邻上游设计高度特异的SNaPshot检测引物,用不同荧光标记的ddNTP对PCR产物进行一步延伸,然后置于310型DNA测序仪上观察荧光信号,可直观的检测上述两位点的单核苷酸多态性。结果　在拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中,经测序证实P基因区不仅存在74 1、74 3位点的变异,还存在5 14C A、5 2 3C A、5 6 2T A、6 6 7C A等位点的变异。对已证实P基因区变异的13例患者血清用SNaPshot技术检测YMDD结果与测序结果完全相同,显示SNaPshot技术高度的特异性。结论　SNaPshot技术检测HBV基因组SNPs具有快速、简便、准确特异的特点,还检测到野生株和变异株的混合存在。     

ISGF3:IFN-α抗乙型肝炎病毒信号转导机制的重要因子

目的　研究干扰素 α(IFN α)抗乙型肝炎病毒(HBV)的信号转导机制。方法　用定量聚合酶链反应(PCR)检测IFNα2b处理前、后的HepG2 2 15细胞上清的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)水平。半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测IFNα2b处理后不同时点的HepG2 2 15细胞和其母源细胞HepG2 细胞内信号转导和转录活化因子1(STAT1)、STAT2、干扰素刺激基因因子3γ(ISGF3γ)、2′5′寡腺苷酸合成酶(2′5′OAS)、RAN依赖蛋白激酶(PKR)的mRNA表达水平。WesternBlot检测ISGF3γ的蛋白质表达水平。并用染料木黄酮阻断IFNα2b信号转导后再次检测上述指标。结果　IFNα2b处理8h后,HepG2 2 15细胞上清HBVDNA平均减少0 72log 10copies ml,而加染料木黄酮后则无减少。IFNα2b处理后,HepG2 和HepG2 2 15细胞中STAT1、STAT2、ISGF3γ、2′5′OAS和PKRmRNA水平明显升高;加染料木黄酮后前3个因子mRNA水平仍然能检测到,而2′5′OAS和PKRmRNA则受到抑制。WesternBlot检测也提示IFNα2b处理后ISGF3γ蛋白质水平升高,加染料木黄酮后其表达受到抑制。结论　Janus酪氨酸激酶(JAK) STAT途径在IFN α抗HBV中发挥主要作用,而ISGF3是该途径的一个重要因子。     

注射用免疫核糖核酸II的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

 目的 研究干扰素刺激基因因子3（ISGF3）在干扰素α（IFN-α）抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制机制中的作用。 方法 应用定量PCR技术检测IFN-α处理前后人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞上清HBV DNA含量，DNA印迹法检测IFN-α处理前后HepG2.2.15细胞内HBV复制中间体的变化，蛋白质印迹法检测IFN-α处理前后HepG2和HepG2.2.15细胞中ISGF3的3个组分即信号转导和转录活化因子（STAT）1、磷酸化STAT2和ISGF3γ以及双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)蛋白质表达水平的改变。用酪氨酸酶抑制剂染料木黄酮抑制IFN-α作用后，再次进行上述检测。 结果 IFN-α处理后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和细胞内HBV复制中间体减少，HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达水平均升高。加染料木黄酮抑制IFN-α后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和复制中间体无减少，而HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达均减少。 结论 ISGF3是IFN-α抑制HBV复制的关键因子。     

丙型肝炎病毒感染自然过程中的准种变化

目的观察丙型肝炎病毒(HCV)持续感染者与自然阴转者外周血HCV准种构成的变化规律。方法应用基因扩增、分子克隆和测序的方法,对未接受过治疗的4例HCV持续感染者与4例自然阴转者前后间隔10年血清中HCV高变区1(HVR1)基因片段进行了序列分析及遗传进化关系比较。结果与持续感染者相比,自然阴转者外周血HCVHVR1区准种群体组内平均遗传距离、熵值较小。4例持续感染者中有3例10年前后血清HCVHVR1准种群体组内与组间遗传距离有明显差异。8例感染者中有7例血清HCV准种KA/KS值大于1。结论在丙型肝炎的自然病程中HCV准种遗传复杂度、变异度大小可能与丙型肝炎的转归相关;HCV准种构成可能发生改变。     

中国大陆新发现丙型肝炎病毒3′非编码区终止密码子变异

目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3′非编码区(3′UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础。方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400bp的cDNA片段,克隆测序。结果获得的全长1b型HCV3′端序列,由高变区、Poly(u)区、Poly(u/c)区及98碱基区4部分组成;首次发现终止密码子突变由TGA突变为TGG,可导致NS5B的翻译不能及时终止。结论半套式RT-PCR法可有效获得病毒基因组的全长末端序列;首次报道终止密码子突变导致NS5B区延长,3′UTR缩短。该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义。     

神经节苷脂 GM1 联合纳美芬治疗重型颅脑损伤的疗效观 察简

目的观察神经节苷脂GMl联合纳关芬治疗重型颅脑损伤的临床疗效。方法将115例重型颅脑损伤患者随机分为神经节苷脂GMl联合纳关芬治疗组（A组）和常规治疗组（B组）,观察两组患者的意识恢复情况、并发症及近期疗效。结果A组在苏醒时间、总有效率均优于B组,且明显降低了呼吸道感染、酸碱平衡障碍等并发症。结论神经节苷脂GMl联合纳关芬治疗重型颅脑损伤疗效确切。