全国多中心临床试验样本收集与冷链运输的质量调查

摘要：目的：调查一项全国多中心临床研究的样本质量及影响因素,为提高临床研究样本质量提供思路。 方法：中心实验室在集中处理样本过程中,针对样本（8 973份）和样本运输（169批次）中与标准操作程序（SOP）不符的质量问题发出疑问表,通过沟通解决疑问,总结、分析相关数据用以调查样本和样本运输质量及其影响因素。 结果：17.2%（1 539/8 973）样本存在质量问题,以“标注缺失”为主,占不合格样本总量的83.6%（1 287/1 539）,其次为“标注错误”（11.1%,171/1 539）和“样本缺失或量不足”（5.3%,81/1 539）。样本质量有较大的地域差异,且与研究中心的入组患者数量和人员配备、实验室条件无关。首次收到疑问表便能主动答复的中心,不合格样本比例由之前的15.8%（648/4 113）降至1.6%（18/1 161）;对不能主动答复疑问表的中心进行SOP再培训,不合格样本比例由27.0%（747/2 772）降至13.6%（126/927）。样本质量问题最终100%（1 539/1 539）解决。样本冷链运输中,11.2 %（19/169）批次温度异常,4.1%（7/169）批次温控记录缺失。 结论：样本质量问题以“标注缺失”为主,对后续检测影响较大的“标注错误”少见;跟踪疑问表并采取质控措施可提高样本质量;需加强样本冷链运输实时温度监控以提高样本运输质量。     

抗呼吸道合胞病毒感染的新药物作用靶点的筛选

目的为了筛选潜在的抗呼吸道合胞病毒药物作用靶标,以呼吸道合胞病毒感染相关的基因为靶标来构建抑制RSV感染的pSUPER RNAi表达载体,通过体外抗病毒实验进行验证,最后筛选出有效的靶基因。方法利用信使RNA（mRNA）差异显示法,获得特定细胞差异表达的mRNA差异显示谱,通过电子克隆获得这些EST片段的电子延伸产物,得到三十余条与RSV感染密切相关的基因。从中选取部分基因序列作为靶点,化学合成2条编码短发夹RNA序列的寡核苷酸链克隆到pSUPER载体上,构建若干靶向呼吸道合胞病毒感染细胞的相关基因的RNAi质粒。通过体外抗病毒实验来筛选有效的作用靶标结果。结果本研究设计的siRNA序列克隆到了pSUPER上相应位置,序列正确。针对RSV基因构建的重组质粒pshRNA-ZQ06/16/20/26均可减轻RSV所致的细胞病变,降低病毒滴度,重组质粒对细胞生长无明显细胞毒性作用,通过噻唑蓝比色法（MTT）从mRNA水平分析并确定了该RNAi效应对靶基因有特异性抑制作用。结论重组质粒pshRNA-ZQ06/20/26较pshRNA-ZQ16抗RSV作用要强。     

完全腹腔镜下胆管空肠Roux-en-Y吻合67例

随着腹腔镜器械的不断改进和升级,腔镜操作技术不断提高,腹腔镜下胆总管空肠Roux—en—Y吻合术（laparoscopic chaoledochaojejunostomy,LCJS）在国内得到发展。我科于2008-06至2013—12在腹腔镜下行胆管空肠Roux—en—Y吻合67例,取得了较好的效果。     

用流式细胞仪富集大鼠骨髓干细胞

目的：建立大鼠骨髓干细胞富集的方法。方法：用常规方法从大鼠胫骨中获取骨髓细胞，采用红细胞裂解液去除红细胞，然后以PE标记的CD3、CD45RA抗体及FITC标记的Thy抗体标记细胞，最后通过流式细胞仪检测并分选Thy CD3^- CD45RA^ 细胞。结果：①大鼠骨髓细胞中CD3^ 、CD45RA^ 和Thy^ 细胞分别约占14．1％、4．2％和20．8％；②流式细胞仪分选的Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞约占2．8％。结论：应用红细胞裂解液去除红细胞及通过流式细胞仪分离Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞是一种较有效的富集大鼠骨髓干细胞的方法。     

两个不同骨髓干细胞亚群体外成肝潜能的比较研究

目的研究与比较骨髓造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)和间充质干细胞(mesen-chymalstemcells,MSCs)肝分化潜能。方法常规法分离培养大鼠骨髓MSCs。以Thy-1.1为标志,免疫磁珠法(magenicactivatedcellsorting,MACS)分离纯化HSCs。探寻MSCs、HSCs的诱导条件,从形态学、RT-PCR和免疫细胞化学法鉴定肝分化结果。结果MACS分选后Thy-1.1 细胞纯度94.20%,细胞活力99.62%。纤维状MSCs诱导后呈圆形,表达白蛋白及其mRNA,不表达甲胎球蛋白。诱导的HSCs为多角形,白蛋白表达逐渐减少,甲胎球蛋白表达逐渐增强。结论MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1 干细胞群。MSCs和HSCs二者具有不同的肝系分化潜能。MSCs在HGF/FGF-4的作用下表达成熟肝细胞的特异性基因,分化为成熟肝细胞样细胞;HSCs在HGF/FGF-1/FGF-2的作用下表达早期肝特异性基因,分化为肝干细胞样细胞。     

注射用免疫核糖核酸II的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

 目的 研究干扰素刺激基因因子3（ISGF3）在干扰素α（IFN-α）抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制机制中的作用。 方法 应用定量PCR技术检测IFN-α处理前后人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞上清HBV DNA含量，DNA印迹法检测IFN-α处理前后HepG2.2.15细胞内HBV复制中间体的变化，蛋白质印迹法检测IFN-α处理前后HepG2和HepG2.2.15细胞中ISGF3的3个组分即信号转导和转录活化因子（STAT）1、磷酸化STAT2和ISGF3γ以及双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)蛋白质表达水平的改变。用酪氨酸酶抑制剂染料木黄酮抑制IFN-α作用后，再次进行上述检测。 结果 IFN-α处理后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和细胞内HBV复制中间体减少，HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达水平均升高。加染料木黄酮抑制IFN-α后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和复制中间体无减少，而HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达均减少。 结论 ISGF3是IFN-α抑制HBV复制的关键因子。     

聚合酶链反应检测TT病毒核酸的优化条件

目的探讨聚合酶链反应(PCR)扩增TTV核酸的优化条件,初步测定慢性丙型肝炎及慢性非甲-戊,非庚肝炎患者中TT病毒的检出率.方法将标本分别予以4℃保存1wk、室温保存1wk及1wk内将标本于-35℃与室温间反复冻融6次3种储存方法.分别以SDS-蛋白酶K方法(方法1),NP-40法(方法2)及聚乙二醇法提取TTV DNA,分别以套式PCR与单管套式PCR检测TTV.以PCR直接序列分析方法测定扩增产物以验证扩增产物的特异性.结果在10份已知病毒标志均为阴性的血清中,方法1与方法2提取核酸后可在4份血清中检出TTV,方法3提取核酸后的检出率为0.1次PCR、单管PCR与单管套式PCR对10份已知病毒标志均为阴性血清的TTV检出率分别为10%,40%和40%.将2份血清按原血清、10-1～10-10系列稀释后检测,发现,1次PCR、套式PCR和单管套式PCR的检出水平分别为原倍、10-5与10-4及阴性、10-4与10-4.4℃保存1wk、室温保存1wk及反复冻融标本的最低检测稀释度为10-5,10-4,10-3与10-4,10-4,10-3.对一份PCR产物进行序列分析证实为TTV特异性基因.检测31份慢性丙型肝炎及32份慢性非甲-戊,非庚肝炎标本,阳性率分别为29.03%和34.38%.结论建立了一种敏感、快速、特异的TT病毒检测方法.在1wk内,不同的标本储存方法对检测结果的影响不大,TT病毒可能是慢性非甲-戊,非庚肝炎及输血后肝炎的重要致病因子.     

慢性丙型肝炎直接抗病毒药物的研究进展和应用前景

针对HCV感染的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林。按此治疗方案部分HCV感染者是可治愈的。但仍有一小部分患者不能治愈。随着分子生物学的进展,针对HCV生活周期中病毒蛋白靶向特异性治疗的许多小分子化合物的研究得到了迅速发展,提高了抗病毒的疗效。这些药物统一命名为抗HCV的直接抗病毒药物(direct-acting antiviralagents,DAAs),包括非结构蛋白(non-structural protein,NS)3/4A蛋白酶抑制剂、NS5B聚合酶抑制剂和NS5A蛋白抑制剂等。本文对慢性丙型肝炎DAAs的研究进展、临床应用、应用中的问题及应用前景进行概述。     

丙型肝炎肝硬化患者抗病毒疗效的影响因素分析

目的探讨丙型肝炎肝硬化抗病毒治疗疗效影响因素.方法以干扰素(interferon,IFN) α为基础抗病毒治疗的丙型肝炎肝硬化患者作为研究对象,收集其流行病学资料、基线的相关化验指标、抗病毒治疗方案及经过.分析抗病毒治疗后获得的持续病毒学应答(sustained virological response,SVR)率及其影响因素.结果 28例经IFN α联合利巴韦林抗病毒治疗的丙型肝炎肝硬化患者入选,9例获得了SVR,占32.1%.SVR组和非持续病毒学应答(non-SVR,N-SVR)组基线性别比例、年龄、感染时限、HCV RNA、转氨酶、中性粒细胞绝对计数、HGB、PLT和Child-Pugh评分均无统计学差异(P > 0.05).应用聚乙二醇干扰素(pegylated interferon,Peg-IFN) α患者的SVR率高于普通IFN α(P =0.003),但去除中途脱落的患者后2组SVR率的差异无统计意义(P =0.308).依从性好的患者SVR率显著高于依从性差的患者(P =0.004).普通IFN α治疗的患者终止治疗的比例显著高于Peg-IFN α(P =0.009),Child-Pugh评分高的患者终止治疗的比例显著高于Child-Pugh评分低的患者(P=0.034).结论丙型肝炎肝硬化患者抗病毒治疗的SVR率较低,主要与其依从性差有关,而依从性与干扰素类型和肝硬化的严重程度有关.     

生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞迁移功能的影响

目的研究生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞（BM—EPCs）迁移功能的影响及其机制。方法雌性BALB／C小鼠随机分成卵巢切除组、假手术组和正常组。ELISA法检测各组血清雌激素浓度。取胫骨和股骨骨髓,培养、鉴定BM—EPCs。Transwell小室检测各组BM．EPCs经或未经CXCR4抑制剂AMD3100处理后向基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）的迁移功能。RT—PCR和流式细胞术检测各组BM-EPCsCXCR4的表达。结果卵巢切除组血清雌激素浓度明显低于假手术组和正常组（P〈0．01）。卵巢切除组BM—EPCs向SDF-1α迁移的数量明显低于假手术组和正常组（P〈0．01）。AMD3100明显抑制BM—EPCs向SDF-1α的迁移功能。卵巢切除组BM—EPCsCXCR4的表达明显低于假手术组和正常组（P〈0．01）。结论生理性雌激素通过调节BM—EPCsCXCR4的表达而增强其迁移功能。