小鼠Q9D3J8(釉成熟蛋白)基因在磨牙牙胚中的表达

目的:报道一新发现的成熟期成釉细胞特异性表达蛋白:釉成熟蛋白(MASP,m ature am elob last-spec ificprote in)。方法:利用生物信息学工具和基因数据库分析位于人4号染色体4q13.3区域的新基因UNQ689;小鼠Q9D3 J8基因为UNQ689的同源基因。根据小鼠Q9D3 J8的基因序列设计引物,扩增长度为982bp的基因片段:分离小鼠下颌第一磨牙牙胚及周围组织,采用RT-PCR技术观察小鼠Q9D3 J8基因在小鼠下颌磨牙组织中的表达。制备D igoxygen in标记的小鼠Q9D3 J8 cRNA探针,以小鼠下颌第一磨牙及其周围组织为研究标本,采用原位杂交技术对Q9D3 J8基因表达进行组织学定位。结果:利用生物信息学工具和基因数据库,发现am elob lastin基因上游一未报道的新基因UNQ689/Q9D3 J8。在染色体基因图谱位置关系上,UNQ689/Q9D3 J8,am elob lastin和enam elin基因紧密相连。RT-PCR产物的琼脂糖电泳显示Q9D3 J8基因在出生后10d和15d的小鼠磨牙组织中表达明显。原位杂交研究显示Q9D3 J8基因仅在小鼠磨牙成熟期成釉细胞中呈特异性表达。结论:本研究提示UNQ689/Q9D3 J8基因为成熟期成釉细胞特异性表达蛋白基因;在染色体DNA上,UNQ689/Q9D3 J8,am elob lastin和enam elin共同组成一个成釉细胞特异性表达蛋白基因串。根据UNQ689/Q9D3 J8基因在组织中的分布和表达,我们暂时将UNQ689/Q9D3 J8基因命名为MASP(釉成熟蛋白)基因。     

TGF-β1调控成釉细胞ODAM基因表达的研究

目的:探讨TGF-β1对ODAM基因表达的作用。方法:通过实时定量RT-PCR法观察TGF-β1对成釉细胞ODAM基因表达的影响;利用c-jun小RNA干扰(siRNA)技术,阻断转录因子c-jun基因表达,观察c-jun基因沉默对TGF-β1诱导ODAM基因表达的影响;利用双荧光素酶基因报告系统研究成釉细胞中TGF-β1对ODAM启动子转录活性的调控作用。结果:TGF-β1刺激成釉细胞后,ODAM基因表达显著增强;利用小RNA干扰技术使c-jun基因沉默,实时定量RT-PCR法研究显示,TGF-β1调控ODAM基因表达的作用减弱。将pGL3-ODAM转染成釉细胞后,用TGF-β1刺激成釉细胞一定时间,ODAM启动子的转录活性增强。c-jun基因沉默抑制了TGF-β1对ODAM启动子的激活作用。结论:在釉质发育过程中,TGF-β1通过转录因子c-jun调控成釉细胞ODAM基因表达。     

转录因子Ets-2调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的研究

目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达;在小鼠成釉细胞中分别转染200ng pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2和Ets-2siRNA后,利用实时定量RT-PCR法检测MMP20基因表达的不同变化;用双荧光素酶报告基因检测系统分析Ets-2对MMP-20启动子突变后转录活性的影响。结果:免疫组化显示Ets-2在成釉细胞中呈阳性表达。实时定量RT-PCR研究发现Ets-2过表达后,MMP-20表达水平显著增加;当Ets-2基因沉默后,MMP-20表达水平则显著下降。双荧光素酶报告基因检测系统检测显示,转染pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2的实验组与对照组相比,MMP-20启动子的转录活性升高;对启动子Ets潜在结合部位进行定点突变后,MMP-20启动子的转录活性显著下降,Ets-2丧失上调MMP-20启动子转录活性的作用。结论:小鼠成釉细胞核中Ets-2可通过MMP-20启动子上Ets潜在结合位点,上调MMP-20基因表达水平。     

活化型TGFβRI(T204D)转基因小鼠的建立及其对牙釉质发育影响的初步研究

目的 建立人活化型TGFβRI(T204D)的转基因小鼠,并利用转基因动物模型初步研究T204D对牙齿釉质发育的影响.方法 克隆小鼠釉原蛋白(Amelogenin,Amelx)启动子及人T204D的全长基因,并利用缺失突变原理扩增T204D基因.运用Gateway技术将T204D基因插入Amelx启动子下游构建转基因表达载体,通过显微注射法建立T204D转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测外源性TGFβRI基因表达.体视显微镜及扫描电镜下观察转基因小鼠磨牙釉质的矿化程度和病理性磨损程度.结果 构建了T204D转基因表达载体并制备转基因小鼠;转入的人T204D基因在小鼠颌骨组织中特异性表达;组织学分析显示:活化型TGFβRI转基因小鼠磨牙釉质矿化程度较野生型小鼠差.6个月龄时,与野生型小鼠相比,活化型TGFβRI转基因小鼠磨牙釉质有严重磨损.结论 TGFβRI在牙齿釉质发育过程中具有重要作用.     

维甲酸体外诱导鼠磨牙牙胚骨涎蛋白基因表达的研究

目的 :观察维甲酸 (RA)对小鼠磨牙牙胚BSPmRNA表达的影响 ,探讨RA在牙胚早期发育中的作用。方法 :将 16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚置于含外源性RA(5× 10 -8mol/L)的RPMI16 40半固态培养基表面 ,分别培养 4、5、6d。培养结束后提取总RNA ,经RT -PCR扩增 30循环后 ,采用Southern印迹法检测BSPmRNA在牙胚组织中的表达。结果 :体外培养 4d后 ,实验组 (含外源性RA )和对照组 (不含外源性RA)的牙胚组织中BSPmRNA的表达均为阴性。培养 5d后 ,实验组的牙胚开始表达BSPmRNA ,对照组的牙胚仍为阴性。培养 6d后 ,实验组牙胚BSPmRNA的表达明显增强 ,对照组的牙胚也开始表达BSPmRNA ,但表达强度明显低于实验组的牙胚。结论 :RA具有诱导牙胚组织细胞分化的功能     

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin), 制备多克隆抗体, 并进行初步鉴定.方法:RT-PCR获得Amelotin成熟肽片段, 构建pET32a-Amelotin, IPTG诱导表达Amelotin, 纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, ELISA检测抗体滴度.Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔, 得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1:12 800.Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin, 免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用.结论:以纯化的Amelotin为免疫原, 成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelotin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础.     

Odaph对牙釉质发育影响的初步研究

目的 利用Runx2条件性敲除小鼠的转基因动物模型初步研究Odaph对牙釉质发育的影响。方法 PCR鉴定转基因小鼠的基因型,实时定量PCR实验方法检测Runx2loxp/loxp鼠和K14-cre-Runx2loxp/loxp基因敲除小鼠下颌磨牙区中Amelx,Ambn,Enam,Amtn,Odam,Scpppq1及Odaph基因mRNA的相对表达含量的改变,最后用免疫组化技术检测Runx2及Odaph在基因敲除小鼠下颌磨牙区的表达情况。结果 实时荧光定量PCR结果显示:与野生型小鼠相比,在出生后10 d基因敲除小鼠中Amelx,Ambn,Enam基因mRNA的相对表达量均上调,Amtn,Odam,Scpppq1及Odaph的表达显著下降;免疫组化染色结果显示:Anti-Runx2在出生后10 d敲除型小鼠成釉细胞胞核中呈阴性表达,Anti-Odaph在出生后10 d野生型小鼠成釉细胞远端呈强阳性表达,然而在敲除型小鼠中表达不明显。结论 Odaph在牙釉质发育过程中具有重要作用。     

Sirt1调控上皮细胞衰老的研究进展

在牙釉质发育过程中,成釉细胞过早衰老和凋亡是遗传性牙釉质发育不全的重要原因。沉默信息调节因子2相关酶1(silent matingtype information regulator 2 homolog 1,Sirt1)是一种依赖烟酰胺腺苷二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）的脱乙酰酶,已被广泛报道参与调节细胞衰老。本文就Sirt1调控上皮细胞衰老研究进展作一综述,从Sirt1的结构特点入手,阐述Sirt1与衰老的关系。研究表明,当上皮细胞受到外界刺激时,Sirt1通过多种途径影响上皮细胞的衰老：Sirt1参与调节线粒体功能和代谢稳态,线粒体功能障碍会影响细胞衰老表型;端粒长度与衰老呈负相关,Sirt1调节端粒延伸所需的端粒逆转录酶的表达,从而正向调节端粒的稳态;DNA受损后会经历损伤修复,未修复的DNA损伤会引起细胞衰老,Sirt1/p53通路可通过减轻DNA损伤抑制上皮细胞衰老;衰老细胞是慢性炎症的来源,慢性炎症也可以多种方式促成衰老,Sirt1通过缓解炎症症状抑制上皮细胞衰老。未来可重点关注Sirt1对成釉细胞衰老的影响,探究其...     

钙离子在牙釉质矿化中的作用

牙釉质的矿化形成是一个信号分子贯穿始终的过程,釉质矿化通过细胞内多种离子与信号通道的紧密调节和上皮与间充质的相互作用,最终使牙釉质成为人体中矿化程度最高、最硬的组织。Ca²⁺作为细胞内重要的第二信使分子,在生物矿化中调节许多过程,其中就包括调节釉质蛋白的表达。在牙釉质的基本结构羟基磷灰石晶体中,约含有60%质量的Ca²⁺,由此可见Ca²⁺是牙釉质的关键和必需成分。因此,Ca²⁺的正常转运在牙釉质矿化过程中起着关键作用。