免疫荧光法与p53单链构象多态性分析检测胸水肿瘤细胞的结果分析

目的：探讨免疫荧光法与Ｐ５３单链构象多态性分析检测胸水肿瘤细胞,在良、恶性胸水鉴别诊断中的价值。方法采用免疫荧光法、血卟啉荧光法,吖啶橙荧光检测胸水肿瘤细胞：Ｐ５３单链构象多态性分析技术检测Ｐ５３基因突变。结果应用免疫荧光法、血卟啉荧光法、吖啶橙荧光法,通过对８１例恶性胸水患胸水肿瘤细胞的检测,其阳性检出率分别为８８．９％、９１．４％和８６．２％;对１８３例良性胸水患胸水肿瘤细胞的检测,其阳性     

肿瘤患者外周血淋巴细胞端粒酶活性的表达

目的 通过检测外周血淋巴细胞端粒酶活性。为癌症的治疗及预后的评估,随访提供可靠的依据。方法 采用PCR-TRAP方法检测癌症患外周血淋巴细胞中端粒酶活性。结果 癌症患43例中,有37例端粒酶表达阳性,总阳性率86%,阳性结果经EB染色后可见间隔6bp的梯形区带。其中,宫颈癌12例中有10例阳性表达,阳性率83%;卵巢癌6例中有6例阳性表达,阳性率100%;肝癌6例中有5例阳性表达,阳性率83%;肺癌11例中有9例阳性表达,阳性率82%,乳腺癌8例中有7例阳性表达,阳性率88%,5例正常对照中未检出阳性。结论 端粒酶活性表达与癌症的发生与发展有密切的关系。对癌症患外周血淋巴细胞端粒酶活性的测定,对癌症的治疗、预后的评估,随访及复发等都有重要的临床意义。     

树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法,并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用。方法 分离外周血单个核细胞,应用GM－CSF及IL－4诱导DC产生,用TNF－α和PGE2促进其成熟,并用肺癌细胞系GLC－82可溶性抗原致敏。将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC－LAK）,用MTT法检测DC－LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 经GM－CSF,IL－4,TNF－α,PGE2作用后,细胞表达CD1a阳性率为71．0％,CD8350．0％,CD14阳性率低于10．0％,高表HLA－I,HLA-Ⅱ和CD45,为典型的DC表型特征。DC－LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC－82,A549,moser和MCF－7）的杀伤率,前为84．7％,66．9％,49．3％和56．0％,后为43．5％,31．3％,45．0％和32．4％。结论 成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC。     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

抗LPS mAb Fab片段cDNA的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 构建抗LPS单克隆抗体Fab段的真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法 以逆转录PCR方法扩增抗LPU mAb重链Fd和轻链cDNA,分别克隆入载体pGEM-Teasy。经测序分析后,再分别亚克隆入载体pcDNA3,构建成重组载体pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC,并以PCR方法扩增pcDNA3-LC中包括CMV启动子、轻链序列和BGH Poly(A)在内的轻链表达序列。经适当的限制性内切酶酶切后,插入到质粒pcDNA3－Fd中Fd表达序列的前部,构建成表达载体pcDNA3-Fab,以脂质体包裹转染CHO细胞。经G418筛选,用ELISA、免疫荧光和Western blot鉴定阳性克隆。结果 用ELISA和免疫荧光法,筛选出4株高表达Fab的细胞株。Western blot显示,表达产物的Mr为50000。同时,ELISA结果显示,该Fab具有良好的结合LP5的活性。结论 成功地在CHO细胞中表达抗LPS mAb的Fab段,为进一步鉴定其抗LPS的作用,使之成为诊断和治疗革兰氏阴性细菌感染的工具奠定了基础。     

细菌生物膜及其临床意义

生物膜是微生物（细菌、真菌、原虫）及其细胞外多糖基质所形成的细菌群落，附着在有生命或无生命物体的表面。对细菌生物膜的形成及其分子机理、致病机制（耐药机制）、检测、控制等方面进行深入研究，可为防治细菌生物膜引起的难治性感染提供新途径。     

聚合酶链反应检测肺炎衣原体方法的建立与初步应用

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在肺炎衣原体检测中的应用。方法参照Ｃａｍｐｂｅｌ报道的肺炎衣原体全基因序列、Ｇ＋Ｃ比例和次级结构设计一对引物，采用ＰＣＲ法检测肺炎衣原体ＤＮＡ及临床标本中的肺炎衣原体感染。结果经对肺炎衣原体、沙眼衣原体、大肠埃希菌、溶血性链球菌、白色念珠菌和结核分枝杆菌培养物进行ＰＣＲ扩增，结果只有肺炎衣原体出现单一４３７ｂｐ的扩增区带；敏感性试验可检测出１０ｆｇ的肺炎衣原体ＤＮＡ；１０份模拟标本均扩增出４３７ｂｐ区带；２２份小儿肺部感染的咽拭子标本中有５份为阳性，阳性率为２２．７％，而显微镜检查只有２例可见包涵体；１２份正常小儿咽拭子标本均为阴性。结论ＰＣＲ法检测肺炎衣原体，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为肺炎衣原体感染的临床诊断提供了科学的依据     

结核分枝杆菌14000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

白念珠菌对氟康唑耐药模型体外诱导方式的比较研究

目的 探讨白念珠菌耐药模型体外诱导方式,从而获得最佳耐药模型,为研究念珠菌耐药机理奠定基础.方法 以氟康唑为诱导药物,选取临床分离的白念珠菌敏感株,分别采用相同药物浓度传代法、氟康唑浓度递增法和强的松龙干预氟康唑浓度递增法,对其进行人工体外诱导.结果 上述三种诱导方式均能使白念珠菌对氟康唑产生耐药,只是在药物的浓度和传代的次数所形成的耐药性时间不同.相同药物浓度传代法,4种氟康唑浓度分别于第8代(34d),12代(40d),16代(42d),20代(48d)呈耐药性;在氟康唑浓度递增法和强的松龙干预氟康唑浓度递增法,当氟康唑浓度递增至32μg/ml时,均能使白念珠菌产生耐药;对经三种不同方式诱导的终耐药株进行诱导耐药株的稳定性实验,当诱导耐药株传至16代时,相同药物浓度传代法和药物浓度递增法MIC值有不同程度的下降;而强的松龙干预药物浓度递增法,将诱导株传至20代时,MIC值无明显变化.结论 三种诱导方式均可获得耐氟康唑耐药模型,浓度递增法比相同浓度传代法,操作步骤少,耐药形成快,加上强的松龙干预,所形成的耐药株耐药性较稳定,为探讨念珠菌感染与预防及其耐药机制研究奠定基础.