人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究

目的建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色葡萄球菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法。结果成功构建了金黄色葡萄球菌重组质粒标准品和金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;将模拟标本与分离培养对比,两者符合率为100%。结论金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为金黄色葡萄球菌感染诊断及食源性金黄色葡萄球菌污染的快速检测提供依据,可用于临床感染诊断及食品卫生监管、商品检验检疫等。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

甲型H1N1流感病毒临床实验室诊断策略

目的 探讨用于甲型H1N1流感患者临床实验室诊断的策略.方法 采用Dot-ELISA法检测流感患者中的甲型流感病毒的抗原,初步明确为甲型流感或排除非甲型流感;采用real-time RT-PCR法检测甲型流感病毒抗原阳性患者中的甲型H1N1流感病毒特异性核酸,进一步确定甲型H1N1流感病毒.结果 对44 448例在西安地区就诊的发热伴有流感样症状者的鼻咽腔取分泌物进行甲型流感病毒抗原筛查,其阳性筛检率为28.25%;对甲型流感病毒抗原筛查阳性的17 714例患者进行甲型H1N1流感病毒核酸检测,其阳性检出率为41.92%.结论 首先用甲型流感病毒抗原筛查,排除非甲型流感病毒;进而在甲型流感病毒的范围内进行甲型H1N1流感病毒的检测,即加快了甲型流感病毒的排查效率,又减轻了甲型H1N1流感病毒核酸检测的压力;进而又减轻了大部分非甲型H1N1流感患者核酸检测的经济负担.该文认为该检测策略为甲型H1N1流感病毒的临床实验室诊断提供了参考,可为甲型H1N1流感病毒感染的控制、诊断,以及合理用药和针对性治疗提供依据.     

5种血清miRNA的检测在前列腺癌诊断中的价值评估

目的 检测miR-141,miR-16,miR-103,miR-574,miR-34b等五种前列腺癌相关的miRNA在前列腺癌患者血清中的含量,评价其在前列腺癌诊断中的价值.方法 收集临床血清样本,将其分为前列腺癌、前列腺增生、PSA升高等三组,提取血清中miRNA.应用荧光定量PCR方法检测相应miRNA的含量,用GraphPad Prism软件进行统计学分析.结果 miRNA-103和miR-34b在前列腺癌患者、前列腺增生患者和PSA增高人群血清中的含量普遍较正常人增高,其中miRNA-34b平均增高2.2×104倍,在所有PSA升高的样本中均增高.其余3种miRNA的水平相对于正常人未呈现显著差异.结论 miR-34b的诊断价值与PSA相当,是一个潜在的前列腺癌诊断性血清标志物.     

西北地区530例临床患者CYP2C19遗传多态性分析

目的采用DNA微阵列芯片法对西北地区人群等位基因CYP2C19*2和*3进行基因多态性检测,以了解本地区人群CYP2C19基因型。方法在完成PCR扩增获得目标片段后,运用DNA微阵列芯片法,通过具有位点特异性的寡核苷酸探针与目标序列的杂交及显色,判读基因多态性类型。结果在530份样本中,由CYP2C19*2和*3等位基因突变而产生的六种基因型(*1/*1,*2/*2,*3/*3,*1/*2,*1/*3,*2/*3)均通过DNA微阵列芯片法检测出。西北地区人群中,CYP2C19*2突变常见,为52.64%(n=279),其中,纯合突变率8.87%(n=47);CYP2C19*3基因突变率为10.94%(n=58),而该位点的纯合突变罕见,仅0.19%(n=1);CYP2C19*2/*3双突变率为3.21%(n=17)。进而据基因型判断强代谢型(EM)465例(n=210+215+40),占87.74%,弱代谢型(PM)65例(n=47+1+17),占12.26%。结论本地区人群CYP2C19快代谢与慢代谢基因型比率与国内其他地区报道相近,但发生于*2和*3位点的杂合型突变率显著高于之前文献报道。其中*2位点的突变频率较*3更为常见(52.64%vs.10.94%)。提示CYP2C19基因多态性存在一定的地区差异,掌握本地区人群的基因分布频率对临床用药具有重要的指导意义。     

肝素结合血凝素蛋白在结核病诊断中的应用研究

目的制备天然和重组肝素结合血凝素（HBHA）蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到大肠埃希菌BL-21中,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达HBHA蛋白,表达蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹法分析后,亲和层析法纯化蛋白,并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时将7H9液体培养基中的卡介苗（BCG）培养至稳定生长期,用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白。观察抗体对不同浓度天然HBHA和重组HBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果所得天然和重组HBHA蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。     

免疫抑制宿主巨噬细胞Toll样受体的表达变化

目的:检测小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达情况及糖皮质激素甲基强的松龙对TLRs mRNA表达的影响.方法:应用RT-PCR检测正常小鼠腹腔巨噬细胞TLR1-13的表达;并以甲基强地松龙为免疫抑制剂,诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA表达变化.结果:已发现的TLR1-13在正常小鼠腹腔巨噬细胞均有表达;小鼠腹腔巨噬细胞经糖皮质激素处理后,部分TLRs在mRNA水平上可被上调.结论:Toll样受体是抗真菌先天免疫的重要组成部分.甲基强的松龙对巨噬细胞有毒性作用,甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少.     

树突状细胞与超抗原联合诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并利用DC和超抗原高聚金葡素（HAS）诱导产生高效特异性抗肿瘤免疫。方法 用GM－CSF和IL－4联合刺激诱导外周血单个核细胞分化为树突状细胞。HAS活化的淋巴细胞称为HASL。将DC与同源淋巴细胞或HASL共培养，分别称为DC－L和DC－HASL。用FCS分析细胞表型，MTT法测定细胞杀伤活性，并观察对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。结果 在体外，DC－HASL对GLC－82细胞具有相对特异的杀伤作用，HASL和DC－L则无明显特异性。这三种效应细胞对荷瘤鼠的肿瘤生长都有不同程度的抑制，DC－HASL抗瘤活性最强。结论 将DC和HAS结合可诱导产生一种高效并具有相对特异性的抗肿瘤免疫活性细胞。     

植绒转运拭子联合显色培养基对鼻腔金黄色葡萄球菌定植的快速筛查

目的 采用植绒转运拭子联合显色培养基对鼻腔金黄色葡萄球菌（SA）定植进行快速筛查，了解耳鼻喉头颈外科患者SA定植情况，为预防SA感染和医院感染防控提供依据。方法 采用eSwab植绒转运拭子采集某院耳鼻喉头颈外科门诊患者鼻前庭标本，以WASPLab微生物自动化系统接种于羊血琼脂培养基和MRSA/SA显色培养基，孵育培养16、40 h，自动拍摄、观察菌落，通过质谱（MALDI-TOF MS）、药敏试验和mecA基因检测对SA进行验证。结果 共采集200份鼻前庭标本，检出SA菌株48株，其中MSSA 23株（占47.9%），MRSA 25株（占比52.1%），鼻腔SA定植率为24.0%，MRSA定植率为12.5%。SA筛查阳性报告平均时间为（17.6±6.1）h。培养与质谱鉴定、耐药表型检测的符合率为100.0%，与mecA基因检测的符合率为97.9%。结论 基于植绒转运拭子联合显色培养基的快速检测方法准确度较高，报告时间较短，可以用于SA定植快速筛查。