基因工程人白细胞介素-2的研制、中试生产及临床应用

人白细胞介素-2(IL_2)是人体免疫网络中起调节作用的一种重要细胞因子,它为活性蛋白,具有免疫增强、抗肿瘤和抗感染的生物活性,能够治疗恶性肿瘤、肝炎、结核和免疫缺陷病,是一个很有潜力和前景的医疗药品。但天然的人白细胞介素-2产量甚微,不能大量生产。用基因工程技术构建的工程菌发酵生产,1L工程菌可得100mg以上的产品,这是应     

重组霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多表位融合蛋白的免疫原性研究

目的　评价霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多价抗原的融合蛋白的免疫原性。方法　在大肠杆菌中表达重组霍乱毒素与恶性疟原虫多价抗原的融合蛋白 ,通过免疫小鼠评价融合蛋白的免疫原性。结果　通过亲和层析纯化霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多价抗原的融合蛋白 ,不加任何佐剂 ,以 5 0 μg/只的剂量免疫C5 7BL/ 6J小鼠 ,3次免疫后 ,CTB抗体滴度达 1∶6 40 0 ,抗疟原虫抗体滴度 1∶16 0 0 ,其CTL活性为 2 0 7%。结论　霍乱毒素具有较好的佐剂作用 ,经融合蛋白免疫的小鼠能产生良好的体液和细胞免疫 ,为评价该抗原的免疫保护作用打下了基础     

原发性肝癌患者的血清内皮抑素水平变化

目的研究原发性肝癌患者血清内皮抑素水平与其临床病理因素的关系.方法用自行制备的内皮抑素多克隆及单克隆抗体采用双抗体夹心ELISA法测定原发性肝癌患者血清内皮抑素水平.结果血清内皮抑素水平在原发性肝癌患者及健康人分别为(39.76±15.85)ng/ml及(28.58±7.92)ng/ml,原发性肝癌患者显著高于健康人(F=7.23,P<0.05);血清内皮抑素水平在原发性肝癌无远处转移与伴有远处转移患者分别为(34.63±12.56)ng/ml、(45.07±21.47)ng/ml,血清内皮抑素水平与肿瘤有无远处转移有关(F=6.97,P<0.05);血清内皮抑素含量在肝癌肿块直径>10cm为(38.94±16.97)ng/ml,而在肿块直径小于10cm的患者为(29.62±11.78)ng/ml,两者具有显著性差异(F=6.13,P<0.05).结论原发性肝癌患者血清内皮抑素水平显著增高并与肿瘤的大小及有无远处转移有关.     

富含GC DNA PCR扩增条件的优化

目的 :探索富含GCDNA的PCR扩增条件 ,为大环内酯类化合物组合生物合成中模块和酶域的任意组合奠定基础。方法 :在PCR扩增体系中 ,添加甲酰胺、甘油、二甲亚砜 (DMSO)、Mg2 等增强剂 ,并选择合适的扩增体系 ,优化富含GCDNAPCR扩增条件。结果 :甲酰胺对富含GCDNAPCR扩增没有影响 ,而甘油和DMSO均可提高富含GCDNAPCR产物的特异性和产率 ,以 5 %～ 10 %DMSO效果最好。使用Roche长片段DNA扩增系统 ,在使用缓冲液 2反应体系中添加 10 %DMSO和提高 0 .2 5mmol LMg2 浓度时 ,可以扩增长度为 5kb、GC含量为 73%的DNA片段。结论 :应用优化的PCR扩增条件 ,可以扩增长达 5kb富含GC的DNA片段 ,可以满足大环内酯类组合生物合成模块和酶域随意组合的需求     

丙型肝炎病毒河北定州株C33c基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

采用反转录ＰＣＲ方法从河北定州地区献血员血清中克隆了丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）的Ｃ３３ｃ抗原基因，序列分析结果表明，该株的Ｃ３３ｃ基因和中国泰安株的同源性为９１．０％，氨基酸序列同源性为９２．２％；与ＨＣＶ河北株的同源性分别为９１．３％和９６．２％；和日本ＪＫ１株的同源性分别为９１．６％和９４．８％。克隆的基因在大肠杆菌中得到表达和纯化，并可用作抗ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂的抗原组分     

重组人Shiga-EGF工程菌发酵工艺研究

目的研究表达重组人Shiga EGF(rhShiga EGF)融合蛋白工程菌的发酵条件。方法通过摇瓶试验优选适合工程菌生长、表达的培养基配方、pH及以乳糖替代IPTG作诱导剂等 ,并在 5L发酵罐上进行试验。 结果采用A3配方的培养基 ,在pH 6 .8条件下 ,以乳糖诱导表达 5h ,5L罐发酵工程菌菌密度 (A60 0nm)达到 15 ,菌体湿重 2 7g/L ,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的 15 %～ 2 0 %。结论确立以乳糖为诱导剂的发酵条件能降低目的蛋白制备成本     

Shiga毒素导向药物的初步研究

作者首次应用Ｓｈｉｇａ毒素Ａ亚基基因（ＳｔｘＡ）与ＩＬ２基因进行融合，并在二者之间插入ＩＬ２基因前１０个氨基酸编码序列作为接头，构建了一种新的融合毒素ＳｔｘＡ－ＩＬ２。所构建的融合毒素在大肠杆菌中获得了高效表达，表达量达到细菌总蛋白的１５％～２０％。经初步纯化后测活，结果表明ＳｔｘＡ－ＩＬ２能特异地杀伤含中亲和力ＩＬ２受体的淋巴肉瘤细胞ＭＬＡ１４４而对不含ＩＬ－２受体的Ｈｅｌａ细胞无明显杀伤作用。在此基础上，我们用白喉毒素跨膜转运结构域基因片段（ＤＴＢ’及ＤＴＢ”）插入ＳｔｘＡ基因与ＩＬ２基因之间进行融合表达从而构建获得了ＳｔｘＡ－ＤＴＢ＇－ＩＬ２及ＳｔｘＡ－ＤＴＢ”－ＩＬ２。白喉毒素跨膜转运结构域基因片段ＤＴＢ”较ＤＴＢ’减少了一个丝氨酸蛋白酶水解位点及一对二硫键。我们期望通过白喉毒素跨膜转运结构域基因片段的插入来增加融合毒素的跨膜转运效率。初步研究表明ＳｔｘＡ－ＤＴＢ＇－ＩＬ２及ＳｔｘＡ－ＤＴＢ”－ＩＬ２的杀伤活性较ＳｔｘＡ－ＩＬ２提高１０倍。本研究表明应用ＩＬ－２与Ｓｈｉｇａ毒素Ａ亚基及其他毒素所构建的融合毒素也许能用于某些血液肿瘤的治疗     

产生霍乱毒素B亚单位的工程菌在LB培养基中的振荡培养

表达霍乱毒素B亚单位的工程菌MM2菌株在LB培养基中能高效合成B亚单位，观察了在培养过程中吸光度、pH及B亚单位产生的动态变化，3L摇瓶振荡培养，B亚单位产量可达16ug/ml。     

PL启动子控制的乙型肝炎核心抗原基因在大肠杆菌中的表达

应用乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对其相应的抗体(抗HBc)及抗HBcIgM的检测,对乙型肝炎的临床诊断、分型、流行病学调查以及对乙肝疫苗安全性鉴定等都具有重要意义。但因HBcAg来自乙肝病人的尸肝或富含Dane颗粒的病人血清中,因此来源困难,不能大量生产。1981年以来,国外报导了应用基因工程技术在大肠杆菌中合成HBcAg来检测抗HBc,取得较好结果。我们实验室于1982年构建了adw亚型HBV无性繁殖系。随后采用bla启动子使HBcAg在大肠杆菌中获得表达,并以这种抗原用ELISA方法检测乙肝病人血清中抗-HBc和抗HBcIgM,获得比较满意的效果。在此基础上,应用基因工程技术构建更高表达HBcAg的工程菌株,本文报告采用γ噬菌体PL启动子,使HBc基因在大肠杆菌中表达。     

乙型肝炎病毒adw亚型基因组的无性繁殖成功

乙型肝炎病毒基因的无性繁殖,为研究乙型肝炎病毒分子生物学、乙型肝炎和肝癌的诊断与防治及应用遗传工程技术研制乙型肝炎疫苗,具有重要意义。我国乙型肝炎发病率较高,据流行病学调查,主要为adr和adw亚型。adr亚型基因组的无性繁殖已由中国科学院生物化学研究所首次克隆成功。我们采用乙型肝炎病毒(HBV)携带者的血浆,经琼脂双扩散和反向间接血凝试验鉴定为adw亚型,电镜观察确有HBV Dane颗粒存在。用30％蔗糖离心富集血浆中的Dane颗粒,以1％NP_(40)裂解,利用内源性聚合酶进行修补单链完全后,于30％蔗糖离心沉淀颗粒,再以SDS、蛋白酶K处理,酚抽,5—20％线形蔗糖梯度离心进行分离和纯化DNA,将所得DNA于琼脂糖凝胶电泳显示为二条带,一条为环状DNA,另一条为线DNA。与~(125)I-HBVDNA(adw亚型)点杂交,表明确系HBVDNA。取90ng经EcoRI限制酶酶解的HBVDNA,与经EcoRI酶切、磷酸单脂酶处理的700ng线形pBR325质粒DNA相