“低钾”诱导神经元凋亡过程中ARNT2上调表达的分析

目的：观察“低钾”诱导大鼠神经元凋亡过程中ARNT2的表达变化，探讨ARNT2与神经元凋亡的关系。 方法： 建立“低钾”诱导神经元凋亡模型，应用RT-PCR分析ARNT2在凋亡过程中mRNA的表达变化，Western blotting分析蛋白质的表达变化，间接免疫荧光与激光共聚焦确定亚细胞定位。 结果： “低钾”诱导30 min后大鼠小脑颗粒神经元ARNT2 mRNA表达水平即明显上调，1h后上调表达最明显，并持续至“低钾”诱导后12 h左右，ARNT2蛋白质水平的表达变化与 mRNA水平的表达变化相似，免疫荧光结合激光共聚焦分析显示ARNT2蛋白定位于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内。 结论： ARNT2分布于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内，在“低钾”诱导的凋亡过程中ARNT2 mRNA与蛋白均上调表达。     

咖啡因对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用及机制

目的　观察咖啡因 (caffeine)对苯妥英 (diphenylhy dantoin ,DPH) 10 0 μmol·L-1处理的大鼠小脑颗粒神经元(cerebellargranularneurons ,CGNs)存活率的影响 ,并探讨其作用机制。方法　体外培养 8d的CGNs,同时给予 10 0μmol·L-1苯妥英和 1 2 5～ 2 0mmol·L-1咖啡因 ,4 8h后行凋亡分析 ;采用dantrolene(2 0 μmol·L-1)、2APB (5 0 μmol·L-1)、nifedipine(10 0 μmol·L-1)和nimodipine(10 0 μmol·L-1)、MK80 1(4μmol·L-1)、KN93(1μmol·L-1)以及MEK1抑制剂PD980 5 9(5 0 μmol·L-1)分别预先孵育 30min ,再与10mmol·L-1咖啡因和 10 0 μmol·L-1苯妥英共孵育 4 8h ,测定CGNs存活率 ,观察咖啡因的作用与 [Ca2 + ]i 的关系 ;Westernblot法检测咖啡因对磷酸化c Jun和磷酸化ERK水平的影响。结果　① 1 2 5～ 2 0mmol·L-1咖啡因可浓度依赖性抑制 10 0 μmol·L-1苯妥英引起的CGNs凋亡 ,显著提高CGNs存活率 ;②dantrolene、2APB、nifedipine和nimodipine、KN93、MK80 1和PD980 5 9均不能取消 10mmol·L-1咖啡因对 10 0 μmol·L-1苯妥英引起的CGNs凋亡的保护作用。③咖啡因可明显抑制苯妥英诱导CGNs中c Jun磷酸化水平的升高 ,但不影响被苯妥英抑制的ERK的活性。结论　一定浓度的咖啡因可保护苯?     

基质金属蛋白酶-3在强直性脊柱炎中的作用和意义探讨

目的通过比较强直性脊柱炎(AS)病人抗肿瘤坏死因子(TNF)-α单克隆抗体药物(remicade)治疗前后的膝关节滑膜细胞的基因谱变化,找出缓解AS病情相关的主要基质金属蛋白酶(MMP)-3,并探讨MMP-3潜在调控的作用和在AS发病中的作用机制和意义。方法从AS病人在remicade治疗前和治疗3个月后的关节滑膜细胞的基因表达谱(用含1176基因的cDNA微阵列检测)结果中筛选的靶基因即差异表达最显著的MMP-3为特异性刺激因子,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测它诱导健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)的炎症相关基因TNF-α、c-jun和c-fos的表达。结果比较AS病人治疗前后的关节滑膜细胞基因差异表达的结果,MMP-3治疗后下调最显著(P=0.0147)。与MMP-3聚类在一起的基因有111个,和MMP-3相关性最强的基因是金属蛋白酶抑制剂前体(TIMP)-1;MMP-3能显著诱导PBMC的TNF-α、c-jun和c-fos的表达。结论在remicade治疗AS过程中,下调MMP-3是最重要的环节之一;通过检测MMP-3在关节滑膜细胞组织中的表达水平可作为AS诊断和病情进展监控的参考指标;MMP-3下调,可能使TNF-TNFR2-JNK-AP-1信息通道的激活状态减弱,从而减少致炎因子的释放,调整异常的基质降解和血管形成等病理因素,缓解AS炎症、减少软骨和骨质破坏的作用。     

C端序列的删除对非出血重组蛇毒纤溶酶的影响

【目的】研究C端序列对非出血重组纤溶酶(rFⅡ)特异性、活性和热敏感性的影响。【方法】通过SOEing PCR方法构建删除C端序列的突变体，突变体和rFⅡ分别在P．pastoris中诱导表达。表达和纯化的蛋白用SDS—PAGE和Westeren blot进行鉴定。之后分析其生化特性。【结果】rFⅡ及突变体通过SDS-PAGE和Westeren blot得到证实。生化分析揭示：①突变体对显色底物N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA的催化效率(Kcat／Km)是rFⅡ的1．9倍；②突变体和rFⅡ对氧化的胰岛素B链拥有共同的优先裂解位点，可是在随后的裂解中开始展现差异：③突变体显示了更高的纤(原)活性；④热处理表明突变体相较rFⅡ对温度的增加更敏感；⑤通过圆二色谱测量，突变体的螺旋比例有所增加。【结论】删除的序列参与rFⅡ的特异性、活性和热敏感性。该序列可作为下一步优化的候选序列。     

荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

[目的]研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异，克隆出与脑缺血相关的基因。[方法]应用荧光差异显示PCR(FDD PCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段，经反向Northern blot杂交，将杂交阳性的片段且经RT—PCR反复验证，选取差异明显的片段进行克隆测序：经生物信息学分析处理，选取同源性低的EST片段R6，利用cDNA5′端快速扩增PCR(5′RACE法)进行基因全长的克隆。[结果]利用5′RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区，扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF)，RT—PCR及Northern blot印迹结果证实了克隆的结果，同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源，同源性96％，编码166个氯基酸，为结构及功能未明确蛋白质，该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q．13)。[结论]应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KAA0280相似的基因，其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调，该蛋白质结构及功能均未见报道及研究，其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。     

孕甾烷-3β,5α,6β-三醇抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡

观察孕烷氧化物孕甾烷 3β ,5α ,6β 三醇 (PTO)对低钾 (5mmol·L- 1)诱导的小脑颗粒神经元凋亡的影响 ,并对其机理进行初步探讨 .采用二乙酸荧光素 (FDA)和Hoechst 332 5 8DNA染色法观察神经元存活率及形态学特征 ;用琼脂糖凝胶电泳分析神经元死亡的生化特征 .低钾引起小脑颗粒神经元凋亡 ,表现为染色体固缩 ,DNA凝胶电泳表现出由大小不一的断裂DNA片段形成的“梯形”条带 .PTO(0 .62 5～15 μmol·L- 1)呈时间和剂量依赖性地抑制上述现象的出现 .蛋白质合成抑制剂环己米特不能改变由不同温育时间造成的PTO对神经元不同保护效果的差异 .结果显示 ,PTO抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡 ,PTO的这一作用可能属于一非基因效应 .     

高钾可诱导培养的小脑颗粒神经元凋亡

采用四唑盐比色、琼脂糖凝胶电泳、乙二酸荧光素染色和Hoechst332 58染色等方法研究高钾对原代培养的大鼠小脑颗粒神经元的毒性作用及其机制。结果发现 :①高钾诱导神经元死亡呈剂量 ( 50～ 10 0mmol/L)和时间依赖性 ;②神经元死亡呈现明显的凋亡特征 :胞体缩小 ,染色质浓缩 ,DNA“梯形”条带形成和蛋白质合成抑制剂 (cycloheximide ,1.0mg/L)可阻断其毒性等 ;③MK 80 1( 2 μmol/L)、尼莫地平 ( 10 μmol/L)、硫酸镁 ( 2 0mmol/L)可阻断高钾的大部分毒性作用。结果提示 :高钾可能通过刺激内源性谷氨酸释放从而诱导小脑颗粒神经元凋亡     

胞内钙离子浓度与咖啡因保护小脑颗粒神经元作用的关系(英文)

用凝胶电泳和 fura- 2荧光技术测定 [Ca2 + ]i方法研究咖啡因对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用与 [Ca2 + ]i 升高之间的关系 .将体外培养的小脑颗粒神经元从高钾 ( 2 5mmol· L-1KCl)培养基中转移到低钾 ( 5mmol· L-1KCl)培养基中 ,神经元发生凋亡 .但低钾引起的神经元死亡可被咖啡因 ( 5- 2 0 mmol· L-1)浓度依赖性地保护 ,且咖啡因的这种作用不受蓝尼定 ( ryanodine) -敏感钙释放阻断剂蓝尼定和丹曲林 ( dantrolene)的影响 ;也不被 L-型钙通道阻断剂硝苯地平 ,尼莫地平 ,维拉帕米和 NMDA受体阻断剂地佐环平抑制 .结果说明 [Ca2 + ]i 的升高并不是咖啡因对小脑颗粒神经元的保护作用所必需的 .     

3β，5α，6β-三羟基胆甾烷诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡

 目的：研究3β,5α,6β-三羟基胆甾烷(Triol)诱导恶性胶质瘤细胞凋亡的作用及其机制。方法：以不同浓度的Triol作用于C6细胞和A172细胞不同时间。采用MTT法检测细胞存活率,Hoechst 33342染色和TUNEL法检测细胞凋亡,试剂盒检测caspase活性变化,蛋白免疫印记方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2家族蛋白的变化。结果：Triol可呈剂量和时间依赖性降低C6细胞和A172细胞的存活率;Triol处理细胞48 h,C6细胞和A172细胞的IC50值分别为（17.8±0.6)μmol/L和(20.6±0.2)μmol/L。Hoechst 33342染色、TUNEL检测和凋亡执行酶caspase-3活性检测结果显示,给药组中2种细胞都出现明显凋亡核象、TUNEL阳性细胞数增多和caspase-3的激活。Triol作用于C6细胞12 h、24 h和48 h后,在凋亡外通路中激活的caspase-8和在凋亡内通路中激活的caspase-9活性均随时间升高,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达量随时间降低,而促凋亡蛋白Bak的表达量随时间升高。结论：Triol通过激活内、外凋亡通路引起恶性胶质瘤细胞的凋亡,且 Bcl-2家族蛋白在此过程中起重要的调控作用。     

苯二氮卓受体的提纯及受体亚基单克隆抗体的制备

用不实验室建立的亲和层析系统成功地址猪脑分离纯化了苯二氮卓受体（ＢＺ－Ｒ）。结合试验显示，纯化的ＢＺ－Ｒ和专一配基最大的结合容量为１９７０ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，解离常数Ｋｄ值为５．７ｌｎｍｏｌ／Ｌ，圆盘电泳和等电聚焦电泳均显示出单一区带。纯化受体经ＳＤＳ一聚丙烯酰胺不连续电泳，可分离出分子量分别为５９ｋｕ、５６ｋｕ、５１ｋｕ、４８ｋｕ和３８ｋｕ的５条区带。用这些区带蛋白免疫动物，得到了３种单克隆抗体，酶联免疫检测显示，它们和纯化受体结合的最大滴度分别为１：３００００，１：２２０００，１：２２０００．免疫印迹显示，３种单克隆抗体分别和５９ｋｕ、５６ｋｕ、５１ｋｕ的亚基结合，显示出单一清晰的反应带。以上结果说明，我室建立的ＢＺ－Ｒ亲和层析系统是一个稳定、重复性好的受体纯化系统。纯化的ＢＺ－Ｒ对专一配基有根高的亲和力并达到较高的纯度。纯化的ＢＺ－Ｒ最少由４个亚基组成。制备的３种单克隆抗体有一定效价及很高的特异性。