未成熟卵母细胞体外成熟培养技术研究进展

<正>1935年,Pincus和Enzmanz[1]观察到兔的未成熟卵母细胞在体外培养条件下可以自发完成卵母细胞的成熟过程,自此在生殖领域引入了一个新的概念即卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)。自1991年Cha[2]等报道IVM技术取得第1例妊娠以来,IVM技术已应用于治疗多囊卵巢综合征(PCOS)的不孕,预     

烧伤血清激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路和核因子κB诱导血管内皮细胞血管细胞黏附分子1的表达

目的观察烧伤血清对血管内皮细胞血管细胞黏附分子(VCAM)1表达的影响,探讨其信号转导机制。方法采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养模型,根据刺激物的不同分为正常血清组(正常血清刺激)、烧伤血清组(烧伤血清刺激)、SB203580组(烧伤血清 SB203580刺激)和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)组(烧伤血清 PDTC刺激)。SB203580组和PDTC组在烧伤血清刺激前1h分别加入10μmol/L SB203580及10mmol/L PDTC.于烧伤血清刺激后即刻(0)、6、12、24和36h检测HUVEC内VCAM-1mRNA的转录水平。检测血清刺激24h后HUVEC膜表面VCAM-1表达水平、上清液中VCAM-1含量及HUVEC与外周血单核细胞(PBMC)之间的黏附情况。结果烧伤血清组刺激后VCAM-1mRNA的表达水平明显升高,在刺激24h时达高峰,随后下降。SB203580组及PDTC组刺激24h时HUVEC中VCAM-1mRNA表达明显下降,与正常血清组比较,差异无统计学意义(P>0.05).HUVEC膜表面VCAM-1表达水平:刺激24h时;烧伤血清组(66.5±6.2)显著高于正常血清组(19.1±1.9,P<0.05);而SB203580组及PDTC组,分别为21.7±2.3、23.1±2.4,与烧伤血清组比较明显降低(P<0.05),与正常血清组比较,差异无统计学意义(P>0·05).培养上清液中VCAM-1含量:刺激24h时,烧伤血清组(125±10)ng/L显著高于正常血清组(23±3)ng/L(P<0.05);而SB203580组(27±5)ng/L及PDTC组(29±5)ng/L均低于烧伤血清组(P<0.05).刺激24h时,烧伤血清组PBMC与HUVEC之间的黏附数为(197±11)%,较正常血清组(100±4)%显著增加(P<0·05),而SB203580组[(113±7)%]及PDTC组[(97±112)%]却明显低于烧伤血清组(P<0·05),与正常血清组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论烧伤血清可通过p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路增强血管内皮细胞VCAM-1的表达,核因子(NF)κB系统参与了这一调控过程。     

烧伤创面组织TGFβ和其I型,Ⅱ型受体的基因表达研究

采用斑点杂交技术观察了大鼠烧伤创面细胞内源性重组转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，ＴＧＦβ）和其受体基因的转录水平，结果表明：正常皮肤组织存在较弱的上述基因表达。热损伤能诱导ＴＧＦβ和ＴＧＦβ受体基因表达，它们的表达随着创面修复的进行而逐渐增强，并在创面修复最为活跃的时相达峰值，尔后随着修复的日趋完成与减弱，表达的水平也逐渐下降，但ＴＧＦβ受体基因表达的水平     

猪烧伤创面中碱性成纤维细胞生长因子的免疫定位

碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）具有调节皮肤成纤维细胞、表皮细胞增殖，促进猪烧伤创面愈合等生物活性。本研究进一步用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的ｂＦＧＦ单克隆抗体来研究猪浅Ⅱ°烧伤创面对外源性ｂＦＧＦ吸收和代谢。实验结果表明，随着用药时间的不同，外源性ｂＦＧＦ在创面各层的分布不一。ｂＦＧＦ可通过毛囊上皮进入，也可有一个由表皮向真皮逐渐转移的过程。研究结果提示浅度烧伤创面对外源性ｂＦＧＦ的吸收可能是一个主动的过程。     

15例肿瘤患者气功锻炼后唾液中5—羟色胺系统、组织胺水平的变化及其意义

对15例患有癌症的气功锻炼者,炼功前与练功后1个月分别检测了其唾液中5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)和组织胺(HM)的含量。结果表明炼功后唾液中5-HT明显低于练功前的水平,5-HT的代谢产物5-HIAA却显著高于炼功前,唾液中HM的含量也明显低于炼功前。本文认为,气功引起5-HT系统和HM含量的变化是否预示免疫系统功能的改善或免疫抑制的解除,值得进一步研究。     

受精早期观察第二极体对胚胎发育及IVF-ET结局的影响

目的:探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗中早期观察第二极体判断受精的方法对胚胎发育及IVF-ET结局的影响。方法:回顾性研究郑州大学人民医院2010年全年行IVF长方案治疗的患者606例,根据病史判断受精障碍风险将其分为两组。A组:受精后4 h拆除颗粒细胞判断早期受精。B组:受精后17～18 h观察受精。分别比较两组年龄、获卵数、卵子成熟率、正常受精率、可利用胚胎率(可利用胚胎数/2PN卵裂数)、胚胎种植率、临床妊娠率及早期流产率。结果:两组可利用胚胎率差异具有统计学意义(P<0.05),其它各项统计指标均未见明显差异(P>0.05)。结论:受精障碍高风险患者在4 h拆除颗粒细胞观察第二极体有降低可利用胚胎率的风险,不建议所有IVF患者使用。     

表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异

目的:研究表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异.方法:从5例成年男性志愿者身体取头部、胸部、背部、臀部、大腿内侧、大腿外侧、上臂内侧、上臂外侧、手掌、足底、包皮及阴囊皮肤标本,采用免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织表皮干细胞标志物角蛋白19(K19)和整合素β1的表达.结果:皮肤基底层K19和整合素β1阳性细胞以包皮和阴囊最多,其次是臀部,背部及四肢近端外侧相应地多于胸部及四肢近端内侧,头皮、手掌及足底皮肤基底层阳性细胞很少.头皮毛囊隆突部及皮下腺管可见较多K19和整合素β1阳性细胞.结论:表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布存在差异,头皮的毛囊隆突部及包皮和阴囊的皮肤基底层存在较多表皮干细胞,背部及四肢近端外侧皮肤基底层表皮干细胞相应地多于胸部及四肢近端内侧.     

西罗莫司对大鼠烧伤后IRS-1 Ser307磷酸化和胰岛素抵抗的作用

目的:探讨西罗莫司对大鼠烧伤后胰岛素受体底物1丝氨酸307(IRS-1 Ser307)磷酸化和胰岛素抵抗的作用.方法:6周龄SD大鼠(体质量160～170g)随机分为假烫伤组(n=8)、烫伤组(n=8)和烫伤 西罗莫司组(n=8).烫伤组和烫伤 西罗莫司组大鼠制成烫伤面积为30%的Ⅲ度烫伤模型,伤后第4天禁食5 h后的大鼠腹腔注射西罗莫司(0.4mg/kg)2h后,进行正常血糖高胰岛素葡萄糖钳夹技术实验,实验后颈动脉放血处死,立即采集肌肉和脂肪标本,采用免疫沉淀和免疫印迹方法分析IRS-1及其磷酸化丝氨酸307和酪氨酸活性的变化,通过免疫组化观察各组肌肉组织中磷酸化哺乳类西罗莫司靶点激酶(mTOR)表达的差异.结果:正常血糖高胰岛素葡萄糖钳夹技术实验中假烫伤组、烫伤组和烫伤 西罗莫司组10%葡萄糖输注率分别为(12.33±0.42)、(6.61±0.27)和(10.35±0.63)mg/(kg·min),烫伤组和其他2组比较差异具有统计学意义(P＜0.01).烫伤大鼠肌肉和脂肪组织中IRS-1 Ser307活性较假烫伤组明显升高(P＜0.05),而IRS-1磷酸化酪氨酸活性较假烫伤组明显降低(P＜0.05).西罗莫司明显降低烫伤大鼠IRS-1 Ser307活性而明显增加IRS-1磷酸化酪氨酸活性(P＜0.05).免疫组化显示烫伤后磷酸化mTOR活性升高,西罗莫司显著抑制了mTOR活化.结论:西罗莫司通过抑制mTOR磷酸化作用从而降低了IRS-1磷酸化丝氨酸307活性,至少部分减轻烧伤后胰岛素抵抗的发生.     

应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞

目的：拟建立体外分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞的新方法，从而得到高纯度的骨髓间充质干细胞。 方法：实验于2002—09／2005-03在解放军第二军医大学附属长海医院烧伤科实验室完成。①选取清洁级7d龄FVB／N小鼠15只，利用免疫磁珠法（CD11b负选）从小鼠的骨髓细胞中分离纯化骨髓间充质干细胞：颈椎脱臼处死后无菌条件下取出小鼠双侧股骨，消毒离断后去除上清及脂肪层，吹打成单细胞悬液后接种于培养基中。贴壁细胞达到90％左右融合后，用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸进行消化，将悬浮的细胞与CD11b抗体避光反应2min。移入已预置入磁场的LD管，不加压通过，收集管中的细胞成分，用培养基重悬并吹打成单细胞悬液后以1×10^9L^-1-2×10^9L^-1的密度接种于培养基中培养。②培养传代后流式细胞仪检测细胞周期、表面标记物，并利用诱导剂观察其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞的能力。 结果：①细胞形态学观察：免疫磁珠法获得的细胞几乎无圆形细胞夹杂。贴壁率高。形态单一呈典型成纤维样、漩涡状生长。体外增殖迅速。②细胞生长曲线绘制情况：细胞贴壁后一两天为细胞生长缓滞期，之后进入对数增长期，六七天后进入平台期。③细胞周期分析结果：G0／G1期细胞约86％，S＋G2＋M期约14％。④细胞袭面标记物检测结果：第3代骨髓间充质干细胞3％表达CD45，68．7％表达CD29，3％表达CD34，89．6％表达CD105。⑤骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞定向分化情况：在地塞米松、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛等诱导剂作用下，脂肪细胞＋成骨细胞诱导组细胞第5天开始油红O染色显示细胞核呈蓝色，细胞内脂滴呈橙色；在β-甘油磷酸钠、2-磷酸-抗坏血酸等诱导剂的作用下，第10天开始AKP染色显示细胞内有致密颗粒形成，Von Kossa染色显?     

罗格列酮对高糖诱导的大鼠系膜细胞NF-κB活性及MCP-1表达的抑制作用

采用正常糖（NG）、高糖（HG）及HG＋不同浓度罗格列酮培养大鼠系膜细胞株。发现HG组单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）mRNA的表达量明显高于NG组，20μmol／L罗格列酮可显著抑制MCP-1mRNA的表达。HG刺激系膜细胞24h可引起系膜细胞核因子κB（NF-κB）的DNA结合活性增强25倍，高糖诱导的NF-κB活化可被罗格列酮所抑制。罗格列酮可通过抑制NF-κB信号转导途径降低高糖诱导的系膜细胞MCP-1的表达。为进一步认识和评价罗格列酮在糖尿病肾病防治中的作用提供了实验依据。