抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.     

鼻咽癌细胞CNE-2L2的蛋白质组学分析：与恶性生物学行为相关的蛋白质

目的寻找与人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性生物学行为相关的蛋白质。方法用蛋白质组学分析高(W)和低(AS)恶性生物学行为的CNE-2L2细胞间蛋白质表达的差异,用实时定量PCR和免疫荧光染色流式细胞术对差异表达的蛋白质做确认,用siRNA抑制细胞中目的基因的表达,Western blot确认目的基因表达的抑制,细胞接种裸鼠的肿瘤生长实验。结果MOLDI-TOF MS分析见12个明显的差异表达蛋白质点。它们是:抗氧化蛋白Peroxiredoxin 2,异构型b;原肌蛋白3;II型TPM4-ALK融合癌蛋白;MLL蛋白;CD44;视网膜母细胞结合蛋白7;微管蛋白,β多肽;ATP合成酶,转H 作用的线粒体F1复合物,β多肽;波形蛋白;D21S2056E蛋白;蛋白酶体(prosome,macropain)26S subunit,non-ATPase,4;ENO1蛋白。前4个在AS细胞高表达,后8个在AS细胞低表达。对积分最高的7个蛋白质的差异表达做了肯定的验证。用siCD44抑制W细胞的CD44表达后,细胞接种裸鼠的成瘤性生长明显抑制。结论蛋白质组学分析见AS细胞与W细胞间有12个差异表达蛋白质,CD44表达减弱与AS细胞的恶性行为减弱相关。     

分泌型小鼠IL-1β表达载体促进Hepa1-6肝癌细胞的增殖和迁移

目的:构建小鼠经典途径分泌型IL-1β真核表达载体,转染Hepa1-6细胞后,检测胞质及上清中IL-1β分泌表达水平,并考察其对肝癌细胞体外增殖活性、迁移能力的影响。方法:利用特异性上下游引物将小鼠AFP信号肽序列和小鼠IL-1β成熟蛋白编码基因进行拼接后,再与pLIVETM载体进行连接,DNA测序鉴定阳性克隆;jetPEI法将重组载体、pLIVETM空载体、pLIVE-lacZ转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6后,经β-gal染色监测转染效率;各转染组经LPS及monesin处理后双抗体夹心ELISA法分析细胞培养上清及细胞裂解液中IL-1β的表达水平;通过MTT方法分析经典途径分泌型IL-1β对细胞体外增殖活性的影响。结果:成功构建出了小鼠分泌型IL-1β真核重组表达载体pLIVE-smIL-1β;β-gal染色后,显示外源基因在3 d左右时转染效率最高;双抗体夹心ELISA法表明转染后与Hepa1-6/mock组细胞相比,Hepa1-6/smIL-1β组细胞胞质和上清中IL-1β的表达明显增高;MTT及细胞迁移实验分析证实,转染Hepa1-6/smIL-1β组细胞体外增殖速度明显加快。结论:该表达载体可以通过经典途径分泌促炎性因子IL-1β且高效表达成熟肽IL-1β,并能够显著促进肿瘤细胞的体外增殖和迁移能力。     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。