人类CD252基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS－PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a（＋）－CD252阳性菌株的诱导时间、温度,以优化出最佳表达条件。采用包涵体纯化法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BalB／C小鼠,采用ELISA法测定血清中抗体效价。结果成功获得表达pET32a（＋）－CD252的阳性菌株。转化有pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒的表达菌经IPTG诱导后,在蛋白分子量标准的31．0～42．7kD之间出现了新的蛋白条带,新的蛋白主要存在于包涵体中。优化表达条件分析表明,在诱导4h、温度37℃、IPTG浓度为1．0mmol／L时,融合蛋白的表达量最高。包涵体洗涤纯化后,经SDS-PAGE电泳证明可得到较纯的目的蛋白。免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1：3200。结论pET32a（＋）-CD252胞外段原核表达载体能够表达CD252蛋白,并获取了目的蛋白的优化表达条件,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

101 OX40信号在免疫应答中的作用

OX40是表达在活化T细胞上的一种糖蛋白，近年来发现OX40及其配体的作用可能与CD4+ T细胞的活化、T细胞与B细胞的相互作用以及Th1、Th2发育，还有某些疾病的发生、发展关系密切。     

OX40信号在免疫应答中的作用

OX4 0是表达在活化T细胞上的一种糖蛋白 ,近年来发现OX4 0及其配体的作用可能与CD4 + T细胞的活化、T细胞与B细胞的相互作用以及Th1、Th2发育 ,还有某些疾病的发生、发展关系密切。     

人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

泼尼松片对稳定期系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化的协同抗粥样硬化作用的疗效观察

目的观察泼尼松片联合抗动脉粥样硬化治疗对稳定期系统性红斑狼疮(SLE)并发动脉粥样硬化的协同治疗效果的观察。方法将2015年6月至2017年12月期间在武汉大学附属医院中南医院门诊或住院部确诊的52例SLE并发动脉粥样硬化患者,随机分为治疗组(26例)和对照组(26例),对照组仅采用抗动脉粥样硬化治疗(拜阿司匹林片、阿托伐他汀钙片),治疗组在其基础上增加泼尼松片治疗,对比两组临床治疗效果。结果治疗组总有效率比对照组高,两组有显著差异性(P0.05),治疗组效果明显优于对照组。结论对稳定期SLE并发动脉粥样硬化患者而言,泼尼松片有着良好协同抗粥样硬化的作用,值得临床推广。     

BCSC-1基因异位表达致鼻咽癌细胞CNE-2L2黏附性增强及细胞周期阻滞

目的探讨BCSC-1基因异位表达导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性行为减弱的机制。方法采用碘化丙啶染色DNA,流式细胞法检测细胞周期;Hoechest33258染色分析细胞分裂情况;细胞聚集实验检测细胞的黏附性;Western印迹分别检测E-钙黏蛋白、α-catenin和p53的表达。结果细胞周期分析显示异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞、野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞分别有55.1%、43.4%和39.4%处于G0/G1期,分别有25.2%、28.7%和30.9%处于S期,分别有19.7%、27.9%和29.7%处于G2/M期。野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞有较多细胞处于有丝分裂相,异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞几乎见不到有丝分裂相。异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性和E-钙黏蛋白、α-catenin及p53的表达水平均高于野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞。结论异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性增强可能与E-钙黏蛋白和α-catenin表达增强相关;异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞阻滞于G1期可能与p53表达增加相关。这些变化可能在细胞恶性行为减弱中发挥作用。     

B细胞超抗原研究进展

Ｂ细胞超抗原是一类能非特异的刺激Ｂ细胞增殖,并促进其合成免疫蛋白的抗原,大多为细菌和病毒产物,也发现人体内自己合成的类似物质。它激活Ｂ细胞的机制与普通怕和Ｂ细胞丝裂原显著不同,微生物超抗原的特征与这些微生物的致病机制有密切关系。     

人α-甘露糖苷酶Man2c1转基因对移植性肿瘤在小鼠体内生长和转移的影响

目的研究人α-甘露糖苷酶(hMan2c1)转基因对小鼠移植性肿瘤生长、转移的影响。方法接种肝癌细胞H22或肉瘤细胞S180于野生型ICR小鼠和3个系的转基因小鼠(28、35和54号)右侧腋窝皮下,连续测量肿瘤体积。分别于接种细胞第9天和第10天处死小鼠,称重肿瘤。分别对肿瘤组织和肺组织进行HE染色。用Tris-NH4Cl破碎脾脏中的红细胞,以Yac-1细胞为靶细胞,检测脾脏中自然杀伤(NK)细胞的活性。结果接种于3个系的转基因小鼠的H22肿瘤或S180肿瘤的体积及重量均显著高于野生型小鼠(P<0.05)。绝大多数转基因小鼠的肿瘤向周围组织侵袭,而野生型小鼠的肿瘤几乎均有包膜。54、35和28号转基因小鼠的H22肿瘤肺转移率分别为30%(3/10)、50%(5/10)和30%(3/10),野生型小鼠的肿瘤肺转移率为10%(1/10);54、35和28号转基因小鼠的S180肿瘤肺转移率分别为16.7%(1/6)、50%(3/6)和33.3%(2/6),野生型小鼠的肿瘤肺转移率为0(0/10)。转基因小鼠脾脏的NK细胞活性与野生型小鼠比较差异无显著性(P>0.05)。结论hMan2c1转基因促进移植性H22肿瘤及S180肿瘤在ICR小鼠的生长、侵袭和转移,hMan2c1转基因对小鼠脾脏NK细胞的活性无影响。     

人OX40融合蛋白的表达及其纯化

目的表达含有人OX40胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为下一步制备抗人OX40单克隆抗体及鉴定打下良好的基础。方法采用冰冷热击法将测序正确的pET32a—OX40胞外段的重组质粒转入表达菌株BL21（DE3）的感受态细胞,接种于含氨苄青霉素的培养基筛选出阳性克隆。将阳性克隆细菌用IPTG诱导培养,收集不同时间的培养产物,离心分离菌体,取菌体超声破菌,离心收集胞质上清和包涵体沉淀,进行SDS．PAGE分析,观察不同时间条件对目的蛋白表达的影响及目的蛋白分布情况,筛选优化表达条件。采用Ni离子亲合层析柱纯化目的蛋白,然后使用超滤管对蛋白进行脱盐处理,并用核酸蛋白检测仪测定目的蛋白的浓度。结果筛选到表达pET32a．OX40的阳性菌株。SDS．PAGE电泳表明,含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后,在蛋白Marker的31．0～42．7kD之间出现了新的融合蛋白带,在胞质和包涵体中均有目的融合蛋白的表达。优化表达条件分析表明,在诱导的不同时间内新蛋白的表达量没有明显差别。用Ni离子亲和层祈柱纯化的蛋白经超滤管进行脱盐处理后,获得的目的蛋白含量为56．266g／L。结论成功获得表达pET32a—OX40的阳性菌株;表达产物经Ni离子亲和层析柱层析处理可获得纯度较高的目的蛋白。     

小鼠Skint6基因突变对脾脏淋巴细胞亚群的影响北大核心CSCD

目的:制备Skint6基因突变小鼠模型,探究Skint6基因突变对小鼠脾脏各淋巴细胞亚群的影响。方法:利用CRISPR/Cas9技术定点突变小鼠Skint6基因,高分辨率熔解曲线(HRM)和DNA测序鉴定Skint6基因突变小鼠(B6-Skint6^(M));取6月龄B6-WT小鼠和B6-Skint6^(M)小鼠,qRT-PCR检测小鼠皮肤Skint6基因mRNA水平,考马斯亮蓝G-250法测定小鼠尿蛋白水平;计算小鼠体质量、脾脏指数和总细胞数并通过流式细胞术(FACS)检测其脾脏中各淋巴细胞亚群比例并计算细胞绝对数。结果:DNA测序结果显示B6-Skint6^(M)小鼠模型制备成功;qRT-PCR结果表明Skint6基因突变不影响皮肤Skint6 mRNA表达。B6-Skint6^(M)小鼠尿蛋白含量明显高于B6-WT小鼠(P<0.05)。Skint6基因突变对小鼠体质量、脾脏指数无显著影响(P>0.05)。FACS结果表明,与B6-WT组小鼠相比,B6-Skint6^(M)小鼠脾脏细胞数及淋巴细胞数明显增多(P<0.01);CD3^(+)T细胞比例及细胞绝对数明显上升(P<0.01,P<0.05),CD19^(+)B细胞比例下降(P<0.05);CD3^(+)T淋巴细胞亚群中CD8^(+)T细胞比例降低(P<0.01),双阴性T细胞(DNeg)比例及细胞绝对数明显上升(P<0.01,P<0.05);CD4^(+)CD69^(+)活化T细胞比例及细胞绝对数上升(P<0.05,P<0.01),CD4^(+)CD44^(hi)T细胞比例及细胞绝对数上升(P<0.01);Treg比例及细胞绝对数明显下降(P<0.001);Tfh细胞比例及细胞绝对数上升(P<0.05);Breg比例及细胞绝对数上升(P<0.05);CD3^(+)T淋巴细胞亚群中非典型CD3^(+)B220^(+)T细胞比例及其细胞绝对数增高(P<0.001)。结论:Skint6基因突变不影响皮肤中Skint6 mRNA表达,但可影响小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例、细胞绝对数和活化状态,从而引起小鼠免疫功能紊乱。