小鼠IL-35基因的克隆及原核表达

目的 克隆小鼠mIL-35两亚基mEBI3,mIL-12p35 cDNA,并构建mIL-35基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 RT-PCR方法从RAW246.7细胞中扩增mEBI3基因及脂多糖体外刺激BALB/c小鼠的脾细胞中扩增mIL-12p35基因,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35基因,并构建原核表达载体pET-30a-mIL-35,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的蛋白的表达.结果 成功克隆了mEBI3、mIL-12p35 cDNA,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35片段,并构建出原核表达载体pET-30a-mIL-35;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为50 000的重组mIL-35蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中.结论 利用构建的原核表达载体pET-30a-mIL-35成功表达出mIL-35蛋白,为进一步探讨mIL-35的生物学功能奠定了基础.     

不同乳腺癌细胞体外侵袭力差异及影响因素

目的探讨不同乳腺癌细胞系体外侵袭能力的差异并筛选其影响基因。方法以2种常见的乳腺癌细胞系MCF-7（低转移株）和MDA-MB-231（高转移株）为研究对象,通过细胞划痕实验、细胞黏附实验以及Transwell侵袭实验分析2种乳腺癌细胞体外侵袭能力差异,实时荧光定量PCR筛选肿瘤侵袭转移相关基因在细胞间的表达差异并采用细胞免疫组化SP法进一步确认。结果MDA-MB-231细胞24、48 h的平均迁移距离分别为（218.75±20.16）、（211.50±16.54）μm,明显高于MCF-7细胞的迁移距离[分别为（130±29.62）、（119.50±25.65）μm]（P<0.01）;MDA-MB-231细胞黏附能力明显高于MCF-7细胞;MDA-MB-231细胞24 h平均穿膜细胞数[（57.75±4.19）个]明显多于MCF-7细胞[（35.50±4.20）个]（P<0.01）;实时荧光定量PCR结果显示,与MCF-7细胞比较,MDA-MB-231细胞中细胞间黏附分子1（ICAM-1）及乳腺癌候选抑制蛋白1（BCSC-1）表达水平[分别为（0.09±0.01）、（0.15±0.03）]均明显降低（P<0.01）,而基质金属蛋白酶14（MMP-14）表达水平（14.43±1.01）明显升高（P<0.01）。细胞免疫组化结果显示,MDA-MB-231细胞ICAM-1以及BCSC-1的表达水平明显低于MCF-7细胞,而MMP-14表达水平明显高于MCF-7细胞。结论乳腺癌细胞系MDA-MB-231的体外侵袭能力明显高于MCF-7细胞,细胞侵袭力可能与细胞内ICAM-1、BCSC-1低表达及MMP-14高表达有关。     

BALB/c小鼠原位移植肝癌模型的建立及鉴定

目的利用小鼠肝癌细胞株H22细胞肝脏原位种植法建立BALB/c小鼠原位移植肝癌模型,为研究肝脏肿瘤奠定基础。方法取新鲜小鼠腹腔传代的H22细胞,生理盐水洗涤2次,调细胞浓度为1×10~7/ml,与Matrigel按4:1比例混合,用10μl微量进样针在开腹直视下沿肝叶长轴种植于BALB/c小鼠的肝左叶,每只5μl,逐层关腹,常规饲养2周后,处死小鼠观察肿瘤形成情况,检测小鼠肝脏原住癌的形成率及小鼠存活率,形态学和病理学方法鉴定造模效果。结果肉眼可见小鼠肝脏出现单个灰白肿瘤结节,病理学方法证实为肝癌,小鼠存活率和成瘤率均为95%,肿瘤大小均匀。结论成功建立了一种稳定、简单可行的BALB/c小鼠原位移植肝癌模型。     

乳糖化赖氨酸与反义x基因质粒复合物体外对HBV表达的抑制

目的研制一种能把基因药物定向导入肝脏组织的小分子肝靶向药物载体。方法用还原氨化法合成乳糖化赖氨酸(Lac-Lys)共价结合物作为肝靶向药物载体。将含HBV反义x基因的质粒在一定条件下与Lac-Lys制成复合物后转染HepG2.2.15。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg。结果经红外光谱定性,成功制备出了Lac-Lys的共价结合物;此共价结合物能与质粒DNA形成复合物,经细胞培养观察可将质粒DNA载入细胞;抗原检测结果显示,含有反义xDNA的质粒在细胞内能有效抑制病毒的复制。xDNA与Lac-Lys的最佳比例是1∶5,最大抑制率是73.2%。结论合成的Lac-Lys可将反义x基因质粒定向载入细胞内,并有效抑制HBsAg和HBeAg的表达。     

小鼠NASP基因突变对脾脏淋巴细胞亚群的影响

目的制备NASP基因突变小鼠,探讨NASP基因突变对小鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响。方法通过ES打靶技术定点突变小鼠NASP基因,提取鼠尾DNA,通过PCR和DNA测序技术鉴定突变阳性小鼠B6-NASP~M,通过RT-PCR和Western blot检测NASP的mRNA和蛋白表达水平。取6月龄B6-WT小鼠和B6-NASP~M小鼠脾脏,计算脾脏指数并用流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞亚群的比例和细胞周期。结果 PCR和DNA测序检测显示,成功制备了B6-NASP~M小鼠;NASP基因突变后不影响NASP蛋白在皮肤、脾脏、胸腺的表达。NASP基因突变对小鼠脾脏指数无显著影响(P0.05)。流式细胞术检测结果表明,B6-NASPM小鼠与B6-WT小鼠相比,其脾脏CD3~+T细胞比例下降(P0.01),CD19~+B细胞比例上升(P0.01);CD3~+CD4~+T细胞比例下降(P0.05),CD3~+CD8~+T细胞比例上升(P0.01),CD4/CD8比值下降(P0.01);NK细胞比例下降(P0.05)。B6-NASPM小鼠脾脏淋巴细胞S期细胞略高于B6-WT小鼠(P0.05)。结论 NASP基因突变不影响NASP蛋白的表达,但可以改变小鼠脾脏的淋巴细胞的比例,造成B细胞比例升高,T细胞比例降低,降低CD4/CD8比值,从而造成小鼠免疫功能紊乱。     

B细胞超抗原研究进展

Ｂ细胞超抗原是一类能非特异的刺激Ｂ细胞增殖,并促进其合成免疫球蛋白的抗原,大多为细菌和病毒产物,也发现人体内自已合成的类似物质。它激活Ｂ细胞的机制与普通抗原和Ｂ细胞丝裂原显著不同。微生物超抗原的特征与这些微生物的致病机制有密切关系。     

BCSC-1和E-钙黏蛋白在乳腺良恶性病变中的表达及意义

目的 观察乳腺癌抑制候选物1(BCSC-1)和上皮性钙黏蛋白(E-cadherin)在乳腺纤维瘤和乳腺导管癌中的表达及意义。方法 采用免疫组化方法检测40例乳腺纤维瘤组织和89例乳腺导管癌组织中BCSC-1和E-cadherin的表达并分析其相关性。结果 在乳腺纤维瘤组织和乳腺导管癌组织中,BCSC-1的表达阳性率分别为82.50%和62.92%,乳腺纤维瘤组阳性率高于乳腺导管癌组(P<0.05);E-cadherin的表达阳性率分别为85.00%和66.29%,乳腺纤维瘤组阳性率高于乳腺导管癌组(P<0.05)。BCSC-1表达与乳腺癌临床特征分析表明,BCSC-1的表达在淋巴结转移患者中阳性率(18.75%)显著低于无淋巴结转移患者(72.60%)(P<0.01);BCSC-1的表达在Ⅰ期中阳性率(86.96%)显著高于Ⅱ期及以上患者阳性率(54.55%)(P<0.01)。Spearman等级相关分析结果表明,BCSC-1的表达与E-cadherin的表达存在正相关(乳腺纤维瘤组r=0.7558;乳腺导管癌组r=0.7162)。结论 BCSC-1和E-cad...     

OX40信号在免疫应答中的作用

OX40是表达在活化T细胞上的一种糖蛋白，近年来发展OX40及其配体的作用有与CD4^ T细胞的活化、T细胞与B细胞的相互作用以及Th1、Th2发育，还有某些疾病的发生、发展关系密切。     

CpG-ODN调节小鼠免疫细胞对HBsAg体液免疫应答性的初步研究

目的：初步探寻能够刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳CpG-ODN序列。方法：应用正交设计法设计含有不同序列的10例CpG-ODN免疫小鼠，以研究影响CpG-ODN免疫活性的6个因素；免疫时间，CpG基序侧翼核苷酸、5‘‘‘‘‘‘‘‘-poly(A)、硫代修饰，回文结构和CpG-基序数量，筛选出量优组合的CpG-ODN。结果：10例CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠均可不同程度地诱导小鼠抗HBsAg抗体水平的变化，显示出CpG-ODN较强的佐剂效应。结论：CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠可诱导小鼠产生强烈的抗体应答，以六个因素均存在时CpG-ODN的免疫刺激活性较强，即10号序列5‘‘‘‘‘‘‘‘-AAAAAACGTTAACGTT-3’为本实验中刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳序列。     

BCSC-1 过表达抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移

目的：研究人乳腺癌候选抑癌蛋白1基因（breast cancer suppressor candidate 1,BCSC-1）过表达对肝癌Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移的影响,并探讨其可能的机制。方法：将pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和空质粒pcDNA3.1/v5-HisB转染的Bel-7402细胞作为BCSC-1组和空载体组,Bel-7402细胞为野生型组。MTT法、Transwell实验、体外黏附实验和划痕实验分别检测BCSC-1过表达对Bel-7402细胞增殖、侵袭、黏附和迁移的影响,Real-time PCR检测BCSC-1过表达对Bel-7402细胞中与细胞增殖、黏附相关的 ICAM-1、PTTG、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA表达的影响。结果：转染pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1后Bel-7402细胞中 BCSC-1 mRNA的表达水平显著高于空载体组和野生组细胞\[（10.58±0.56）vs（1.10±022）、（1.00±0.01）,均P＜0.01\],成功制备 BCSC-1 稳定过表达的Bel-7402细胞株。与空载体组和野生型组相比, BCSC-1组Bel-7402细胞生长速度明显减慢\[72 h：（0.29±0.003） vs （0.34±0.014）、（0.35±0.013）,均P<0.05\];侵袭率\[（76.20±1.85）% vs（93.42±3.24）%、（100.00±1.05）%,均P<0.01）\]、黏附率\[（58.57±0.84）% vs（97.14±0.84）%、（100.00±130）%,均P<0.01\]显著降低,迁移距离显著降低\[（116.60±10.58） vs （231.33±10.26）、（237.96±11.58）μm,均P<001\];同时过表达 BCSC-1的Bel-7402细胞的OPN mRNA表达量明显降低\[（0.12±0.06) vs (0.95±0.14）、（1.00±0.08）,均P<001\], ICAM-1、PTTG mRNA表达无明显变化。结论： BCSC-1过表达能够抑制Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移能力,其机制可能与OPN基因表达下降有关。