ELISPOT技术在抗肿瘤疫苗研究中的应用

在肿瘤疫苗治疗前后，如何准确的定量，定性判定肿瘤抗原特异性T细胞反应，评价疗效，是影响抗肿瘤疫苗发展的关键，ELISOPT法是近年来逐渐建立起来的一种通过检测细胞因子评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法，它能够对T淋巴细胞直接进行检测，不需要体外扩增，特异性，敏感性都有所提高，经过可行性分析和多中心对比研究，该技术不仅可用于监测肿瘤疫苗的疗效，也能用来鉴定肿瘤抗原表位，很有可能在完成的与其他方法的比较后ELISPOT将会成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选。     

人鼻咽癌细胞的单克隆抗体

用低分化鼻咽癌上皮样细胞系CNE-2免疫小鼠,用淋巴细胞杂交瘤技术产生了抗人鼻咽癌(NPC)细胞表面抗原的单克隆抗体,命名为CN-1,CS-a8,CS-c_1。三株单抗均与鼻咽癌上皮样细胞系反应,不与正常人混合外周血淋巴细胞,RBC和培养的人胚纤维母细胞反应。与NPC以外的瘤细胞系和某些胚胎     

The Test of Immunoglobulin A Antibody of EB Virus Capsid Antigen in 31 Cases of Nasopharyngeal Carcinoma

The immunofluorescent cytochemical method was used to test VCA-IgAantibody of serum EB virus in 31 cases of nasopharyngeal carcinoma andin 13 patients with non-nasopharyngeal carcinoma.The positive rate ofVCA-IgA antibody was 89.28% in nasopharyngeal carcinoma patients.Sixcases of other malignant tumors of the head and neck were negative.Fivein 7 cases of chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa were alsonegative.The control experiments manifested no false positivity or nega-tivity.The results suggest that VCA-IgA antibody of EB virus has definitespecificity in nasopharyngeal carcinoma patients.EB virus probably hasetiologic significance.This paper demonstrates the intimate relationship between EB virus andpoorly differentiated squamous carcinoma,whereas well differentiated squ-amous carcinoma and adenocarcinoma may probably bear no relation to EBvirus.Clinical observations confirm that VCA-IgA antibody test is of somevalue in early and differential diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.     

肝癌MAGE-n抗原HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测

目的 预测肝癌MAGE—n抗原HLA—A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法 应用SYFPEITHI超基序多项式法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法，筛选MAGE—n抗原HLA—A2限制性CTL表位。结果 筛选到MAGE—n抗原5个HLA—A2限制性CTL表位(九肽)。结论 SYFPEITHI超基序法和量化基序多项式法结合的预测方法是一种高效和准确的表位预测方法。     

超抗原单次和多次诱导T细胞膜表型及细胞因子释放的变化特征

目的:观察超抗原SEA体外单次和多次诱导T细胞的细胞膜表型及细胞因子释放的变化特征。方法:SEA体外单次和多次诱导小鼠脾淋巴细胞,用流式细胞术检测CD4、CD8、CD69、CD25、CD28及细胞膜上和细胞内CTLA-4(CD152)的表达,并测定细胞培养上清中IL-2、INFγ-、TNFα-、IL-4和IL-10的水平。结果:1次SEA诱导组(1×SEA组)中,CD4、CD8、CD69、CD25和CD28的表达均显著增加,CTLA-4的表达低,IL-2、INFγ-、TNF-α的水平显著增加。2×SEA组中,CD4、CD8、CD25和CD28的表达也有较明显的增高,CD69的表达未继续上升,CTLA-4的表达显著增加;IL-4和IL-10的水平明显增高。3×SEA组中,CD4和CD8的表达无明显增减,CD69、CD28和CTLA-4的表达显著降低,CD25的表达与2×SEA组相似;IL-10的水平仍继续上升。结论:SEA初次诱导小鼠脾淋巴细胞时,能显著促进T细胞的活化和增殖;经SEA多次刺激(3次)可诱导T细胞的无反应性。     

肿瘤特异性抗原纳米脂质体的制备及特性鉴定

目的:制备包裹肿瘤特异性抗原MAGE3/HSP70-FITC的纳米脂质体,研究其特性及树突状细胞(DC)对其摄取的情况。方法:采用薄膜分散法,制备包裹MAGE3/HSP70-FITC的纳米脂质体(简称NEMH-FITC),观察其形态并测量其粒径,凝胶层析法检测纳米脂质体的包裹率和载药量,并检测其稳定性。将人外周血DC与NEMH-FITC共育后,用激光共聚焦显微镜观察DC摄取NEMH-FITC的情况。结果:成功地制备出平均粒径为95nm左右的纳米脂质体,其包裹率为37%,载药量为0.037g/L,于4℃放置6个月后性质稳定。激光共聚焦显微镜下观察到NEMH-FITC可被DC摄取。结论:纳米脂质体具有良好的包裹率和载药量,可有效地增强抗原递呈细胞对所载药物的摄取,可作为肿瘤抗原疫苗的新型载体。     

肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体的构建及体外生物学活性鉴定

[目的]构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因重组腺病毒载体。[方法]首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2。将AFP增强子、启动子及SEA基因分别从已构建的pKS-EP载体和pMD18-T-SEA载体上,亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa1-6和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3。采用间接免疫荧光法,经荧光显微镜观察和流式细胞术检测SEA在细胞膜表面的表达。采用3H掺入法检测膜表达的SEA体外诱导淋巴细胞增殖的活性。[结果]SEA能够靶向性地表达在高表达AFP的Hepa1-6细胞膜上,在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达,并且体外能够诱导淋巴细胞增殖。[结论]成功地构建了肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体,为进一步研究SEA在肝癌靶向基因治疗中的应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础。     

连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞及其超微结构的观察

目的改进人外周血单个核细胞分离培养树突状细胞的方法,电镜观察树突状细胞超微结构。方法利用连续贴壁法分离获得CD14 前体细胞,经人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导产生成熟DC,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,透射电镜(TEM)观察树突状细胞超微结构。结果连续贴壁法体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离培养的DC。培养1周的DC高表达CD1a、CD40、HLA-DR、CD80、CD86。透射电镜观察到不同状态树突状细胞的超微结构。结论连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源DC。     

肝癌单克隆抗体的质控及其体内导向研究

用肝细胞癌手术切除标本，制备细胞悬液，免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术，获得一组高亲和性肝癌单抗HAb18，F11，E5，A10，四株抗体经免疫组化染色，均显示对肝细胞癌有较好的选择性。用碘标记F11，E5，A10，HAb18IgG及其F(a，b’)2片段抗体，对荷肝癌裸鼠进行放射免疫显像，显示出较好的定位作用。其瘸／肝比值分别为688．5．14，667，616，14．47。均比有关文献（Dunk AA，1987)报道的定位效果好。用^132I-HAb18IgG及其片段抗体进行荷肝癌棵鼠的放免导向治疗，其显效者为5／12；部分缓解者为6／12。HAb18碘标记物经质控，符合“人用鼠源性单抗的制备及质量控制要点”并进行肝癌病人的体内显像，阳性率达865N(45/52)，其中最小定位的肿瘤直径仅0.5cm：用于体内导向治疗，部分缓解率达69．6%(16／23)。以上研究为肿瘤的综合治疗开辟了新路径。     

增强型绿色荧光蛋白的基因克隆、表达及蛋白纯化

目的研究增强型绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein,EGFP)基因在大肠杆菌中的基因克隆、重组表达及纯化。方法采用PCR方法克隆EGFP全长cDNA序列,构建原核表达载体pGEX4T-1-EGFP,经过DNA序列测定证实其序列正确,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,用谷胱甘肽-Sepharose4B层析法纯化GST-EGFP融合蛋白。结果成功地克隆了EGFP全长cDNA序列,并进行原核表达以及蛋白的纯化,GST-EGFP的表达量占菌体蛋白量的40%以上。经纯化后纯度高于90%。菌体超声裂解后上清液及其纯化产物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光。结论本研究为应用EGFP追踪细胞吞噬功能等动态活动奠定了实验基础。