肿瘤坏死因子-α基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究

目的：探讨肿瘤坏死因子-α(TNF—α)基因多态性与广东地区汉族人群散发性阿尔茨海默病(SAD)发病易感性的关系。方法：采用聚合酶链反应．序列特异性引物(PCR-SSP)方法，检测44例SAD病人及45例正常老年人(对照组)TNF-α基因的TNF—α1及TNF-α2等位基因频率。按比值比(odds ratio，OR)作疾病关联分析。结果：SAD病人TNF-α2基因频率为0．182，明显高于对照组的0．078(OR=2．635，P=0．039)；而SAD病人TNF—α1基因频率为0．818，明显低于对照组的0．922(OR=2．635，P=0．039)。结论：广东地区汉族人群中。TNF-α基因多态性与SAD有关联，TNF-α2等位基因与SAD的易感性有关，TNF-α1等位基因对SAD有保护作用。     

人Persephin基因重组腺病毒载体构建及在C17．2神经干细胞的表达

目的:Persephin是近年来发现的对多巴胺神经元的发育与分化起调控作用重要基因,单纯神经干细胞系C17.2移植治疗帕金森病在体内分化为多巴胺能神经元比例不高。实验构建了人Persephin基因重组腺病毒载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成(广东省重点实验室)。①实验材料:流产胚胎由中山大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均签署知情同意书。病毒骨架质粒载体pAdEasy-1、穿梭载体PAdTrack-CMV(含绿色荧光蛋白基因)、大肠杆菌菌株BJ5183和DH5α、人胚肾293细胞均为本室保存。C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠。②实验方法:采用反转录聚合酶链式反应从人胚胎脑获得PersephincDNA。将重组质粒pAdTrack-CMV-Persephin与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVPersephin,转化体外培养的C17.2神经干细胞。③实验评估:用原位杂交、免疫组化、Westernblot法检测Persephin在C17.2神经干细胞中的表达。结果:①人Persephin基因的克隆与测序分析:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,其Persephin基因片段长约310bp,与预期分子量相符。Persephin基因被克隆于载体pMD18-T,以SaiⅠ和XhoⅠ双酶切可回收长约310bp的克隆片段,测序结果证实所克隆的为人PersephincDNA。②大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组及鉴定:Persephin重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-Persephin用PacⅠ酶切可切出4.1kb的目标片断,PCR鉴定可从重组腺病毒质粒中可扩增出PersephincDNA片断(310bp)。病毒滴度在脂质体转染后为1.9×107pfu/L。用收集的上清4次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度经绿色荧光蛋白检测达3.0×1011pfu/L。③Persephin基因在C17.2神经干细胞中的表达:免疫组化与原位杂交显示转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞胞浆中有Persephin蛋白和mRNA表达。提取感染病毒的C17.2神经干细胞的总蛋白,经Westernblot检测可见一特异性蛋白条带存在。结论:采用RT-PCR法成功克隆人PersephincDNA并构建其腺病毒载体,获得了稳定表达Persephin的神经干细胞克隆,为进一步分析转基因神经干细胞治疗神经退行性疾病提供可行的操作方法。     

反义阻断α-Synuclein表达对PC12细胞凋亡的作用

目的：观察α-Synuclein表达对6-羟基多巴诱导的多巴胺能细胞凋亡的影响及分析其在帕金森病发病机制中所起的作用。方法：实验于2001～12／20014-10于中山大学第一附属医院神经科实验室完成。用100μmol／L的6-羟基多巴诱导PC12细胞凋亡。采用多组样本的完全随机设计方法，将1&;#215;10^5个细胞接种于4块四孔培养板中，共16个孔，随机分为4组：反义、正义、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组。前3组分别加入相应的寡核苷酸5μmol／L治疗24h，空白对照组不加。反义寡核苷酸阻断PC12细胞α—Synuclein表达，用原位杂交和定量Westerm plot检测其基因和蛋白表达；凋亡原位末端标记检测试剂盒检测6-羟基多巴诱导的PC12细胞凋亡。全自动图象分析系统测量有关平均积分吸光度。用SPSS 10．0软件进行统计学分析。结果：①反义阻断后α—Synuclein mRNA表达：反义寡核苷酸治疗组较空白对照组明显减少（P〈0．01），正义寡核苷酸治疗组和无义寡核苷酸治疗组与空白对照组比较无差异（P〉0.05）。②α—Synuclein蛋白表达：反义寡核苷酸治疗组明显减少，较空白对照组减少约53．93％（P〈0.05）。正义寡核苷酸治疗组、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组之间差异不显著（P〉0.05）。③6-羟基多巴治疗后的反义寡核苷酸治疗组、正义寡核苷酸治疗组、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组随机计数的200个细胞中，凋亡细胞数量间相互比较无显著统计学意义（P〉0.05）。结论：α—Synuclein表达减少对6-羟基多巴诱导的PC12细胞凋亡无影响。推测在帕金森病的多巴胺神经元凋亡的发生机制中，α—Svnuclein在神经元内的异常聚集较其表达量的多少更重要。