日本血吸虫钙连蛋白(Canx)基因克隆与表达

<正>目的:钙连蛋白(Canx)在蛋白质合成中起重要作用,存在于内质网中需Ca2+的凝集素样分子伴侣蛋白,可与新合成的尚未折叠完全的蛋白质的寡糖链结合,防止蛋白质彼此聚集和泛素化,避免折叠不完全的蛋白质离开内质网;同时也可促进其它伴侣蛋白与这些蛋白质结合,使其折叠完全。无论是曼氏血吸虫还是日本血吸虫,仅有与Canx相似的钙结合蛋白的研究报道。本文报道与宿主相关的日本血吸虫Canx基因的克隆、表达,为研究其功能奠定基础。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录得到cDNA。设计引物用常规PCR法扩增出Canx编码基因,在设计引物时,切除了含21个氨基酸的信号肽,     

日本血吸虫酪蛋白激酶2α的表达、定位与免疫效果观察

目的:克隆、表达日本血吸虫酪蛋白激酶2α(SjCK2α)基因,并定位表达,观察其表达产物的免疫效果。方法:首先针对SjCK2α基因的开放阅读框设计特异性引物,以日本血吸虫成虫RNA逆转录后的cDNA为模板,扩增目的基因;并使其带上限制性内切酶酶切位点,获得SjCK2α的目的基因片段,回收后连入表达质粒pET28a(+)。重组质粒pET28a(+)-SjCK2α转化入BL21细胞,构建表达菌;并用IPTG诱导表达菌的表达;用Ni-NTA树脂纯化后透析,收集重组目的蛋白。用重组蛋白免疫家兔制备多克隆血清。免疫组化法对皮肤型童虫、肺型童虫和常规培养肺型童虫进行组织学定位。将重组蛋白免疫小鼠,再用日本血吸虫尾蚴攻击感染,6周后剖杀,灌注法收集日本血吸虫成虫,计算减虫率;摘取肝脏组织剪碎、KOH消化后收集虫卵,计算减卵率;摘取眼球取血,收集血清,ELISA检测细胞因子干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的含量。另设感染对照组和化工剂对照组进行比较分析。结果:扩增的目的基因SjCK2α基因片段长度为1047bp,构建的重组质粒pET28a(+)-SjCK2α转化入BL21细胞后,构建的表达菌在IPTG诱导下获得大量重组蛋白,纯化后免疫家兔获得多克隆血清。免疫组化染色发现,SjCK2α主要定位于童虫表面。将重组蛋白免疫小鼠后,攻击感染6周后获得15%的减虫率和17%的减卵率,与对照组的减虫率和减卵率差异无统计学意义(P0.05);此时,感染对照组的IFN-γ和IL-4含量分别为42.77±12.11和17.31±9.13,佐剂对照组的IFN-γ和IL-4的含量分别为30.99±16.55和18.65±7.52,重组蛋白免疫组的IFN-γ和IL-4的含量分别为36.19±14.56和9.90±5.20,三组间两指标比较均无统计学差异(P0.05)。结论:本实验成功克隆和表达SjCK2α基因,其主要表达于童虫表面;SjCK2α免疫小鼠后未能获得免疫性保护。     

日本血吸虫培养细胞内糖类物质的动态变化及肝基质对其的影响

目的研究日本血吸虫成虫培养细胞内糖类物质的动态变化以及肝基质培养对其的影响。方法将虫龄为32d的日本血吸虫成虫细胞随机分为2组,实验1组(普通组)细胞接种于普通小盖玻片上,实验2组(肝基质组)细胞接种于预先铺敷有肝基质的盖玻片上,细胞培养基为RPMI-1640(含20%小牛血清附加常量抗生素)。每周取各组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的水平及分布变化。在培养第1周和第5周分别取2组染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖水平的A值,并做统计学分析。结果随着培养时间的延长,实验1组的4种类型细胞的糖水平逐渐减少,细胞内不含糖原;而实验2组细胞的糖原和糖类物质逐渐增加。培养第1周,2组细胞几乎均不含糖原,但实验1组细胞的糖水平高于实验2组,差异有统计学意义(u=7.10,P<0.01)。培养第5周,实验1组细胞糖原仍甚少,而实验2组细胞的糖原水平明显增加(u=9.32,P<0.01);并且实验2组细胞的糖水平显著高于实验1组细胞(u=16.89,P<0.01)。培养过程中,实验1组未见分裂细胞,但实验2组可观察到分裂细胞。结论日本血吸虫培养细胞内糖类物质随培养时间的延长逐渐减少;肝基质能增强培养细胞合成糖物质和生长增殖能力。     

斯氏狸殖吸虫成虫畸形的发现

关于吸虫的变异，在卫氏并殖吸虫曾有报道［１］，主要呈现在虫体及内部器官大小方面。在日本血吸虫，报道生殖腺、肠支变异或畸形的较多［２～４］，认为某些畸形与返祖现象有关［２］。而虫体外形轮廓畸形的未见报道。我们在做动物模型实验时，偶然发现一罕见的斯氏狸殖...     

MNNG对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质作用

目的研究甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质动态的影响.方法将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,置于RPMI-1640含20%小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中培养.培养第4 d,细胞被随机分为实验组和对照组.实验组细胞用含3μg/ml MNNG的常规培养基处理48 h,对照组细胞用不含MNNG的常规培养基作相同处理.细胞经彻底清洗后,继续以常规培养基培养3周,然后换用含5%小牛血清的低血清培养基培养.NNNG处理后第1～8周,每周取实验组和对照组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的含量及分布变化.取培养第6周的染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖含量的吸光度,并作统计学分析.结果随着培养时间的延长,对照组培养细胞的着色逐渐变浅,糖含量逐渐减少;实验组细胞的着色则逐渐加深,糖类物质和糖原含量均增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).MNNG处理后第5周,实验组细胞着色最深,核质着色型第二类细胞和分裂细胞数目显著增加.结论MNNG诱导后,日本血吸虫成虫培养细胞内糖原和糖类物质含量均明显增加,分裂细胞增多.     

鼠胚胎成纤维细胞饲养层及其与肝基质联合对日本血吸虫童虫培养细胞LDH、ACP影响的研究

目的以乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)为评价指标,研究鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层及其与肝基质联合对日本血吸虫童虫培养细胞代谢的影响。方法实验分MEF与肝基质联合组(后简称联合组)、MEF组、肝基质组和对照组4组。联合组与肝基质组预先铺敷肝基质,MEF组和对照组未铺敷肝基质,将虫龄21d的日本血吸虫童虫细胞分别接种于预先铺敷或未铺敷肝基质的小盖玻片上。肝基质组和对照组细胞培养于RPMI1640含20%小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中,联合组与MEF组的细胞培养于有MEF饲养层的常规培养基中。培养第7d,运用酶细胞化学方法对日本血吸虫童虫培养细胞进行LDH、ACP染色,OlympusBX51显微镜下观察并拍照,HIPAS2000图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果4组童虫培养细胞其LDH、ACP活性不同。LDH、ACP着色按联合组、MEF组、肝基质组、对照组依次变浅。定量分析显示,培养细胞的LDH含量,各组之间两两比较差异具显著性(P<0.01);联合组、MEF组、肝基质组培养细胞的ACP含量两两比较存在显著差异(p<0.01),联合组、MEF组与对照组之间比较差异具统计学意义(P<0.01),而肝基质组与对照组之间差异无显著性(P>0.05)。结论MEF饲养层能促进日本血吸虫童虫培养细胞的代谢,并能与肝基质协同促进培养细胞代谢。     

甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞骨架作用的研究

目的 通过观察N－甲基－N－硝基－N－亚硝基胍（MNNG）诱导日本血吸虫培养细胞后骨架的改变,研究MNNG对培养细胞转化、增殖的作用。方法 将日本血吸虫成虫培养细胞接种于小盖玻片上,培养1周时用浓度为3mg/L的MNNG处理48h,然后用RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗菌素的培养基培养2周,再换用RPMI－1640含5％小牛血清的培养基继续培养,用考马斯亮兰染色法和鬼笔环肽荧光染色法显示培养细胞骨架。结果 MNNG诱导后,在培养第4、5周时部分培养细胞骨架排列紊乱,微丝集聚于细胞边缘。结论 MNNG有一定诱导日本血吸虫成虫培养细胞转化、促进其分裂的作用。     

恒稳电磁场对体外培养的日本血吸虫童虫细胞LDH的影响

目的以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为评价指标,探讨恒稳电磁场对感染21d虫龄的日本血吸虫童虫培养细胞LDH的影响,筛选恒稳电磁场作用的最适强度与时间。方法将虫龄为21d的日本血吸虫童虫细胞接种于小盖玻片上,培养于常规培养基中。接种后第2d,将一部分细胞分别置于强度为0Gs(对照)、5Gs、10Gs、15Gs、20Gs、25Gs的恒稳电磁场中作用48h;另一部分置于20Gs磁场强度中分别作用为0h(对照)、12h、24h、36h、48h、60h、72h。然后运用酶细胞化学方法对日本血吸虫童虫培养细胞进行LDH染色,Olympus-BH2显微镜下观察并拍照,HIPAS-2000图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果日本血吸虫童虫培养细胞经不同强度恒稳磁场处理后其LDH着色均比对照组深,其中20Gs组的着色最深,其次是15Gs组,再是10Gs组,5Gs组与25Gs组细胞的着色相似,为最浅;统计分析显示,恒稳磁场处理后的各组培养细胞其LDH活性与对照组之间的差异均显著(q5/0=32.7054,q10/0=51.1946,q15/0=74.6917,q20/0=82.5062,q25/0=33.5342,P<0.01);各处理组之间两两比较,除5Gs与25Gs组间差别不显著(q5/25=0.4181,P>0.05)外,其余各组之间差异均有统计学意义(q5/20=49.5414,q5/15=41.4658,q5/10=18.33163,q10/25=18.1466,q10/20=31.3085,q10/15=23.0460,q15/25=41.5878,q15/20=8.5468,q20/25=49.7640,P<0.01)。相同磁场强度作用不同时间后,随着作用时间的延长,细胞的LDH逐渐变深,48h时达到最深,之后逐渐变浅;统计分析表明,不管磁场作用多长时间,培养细胞的LDH活性均明显强于对照组(P<0.01);各实验组之间两两比较亦然。结论恒稳电磁场可以明显增强日本血吸虫童虫细胞的LDH活性,其最佳作用强度与时间分别为20Gs、48h。     

鼠胚胎成纤维细胞饲养层及与鼠尾胶联合促日本血吸虫培养细胞贴壁作用的研究

目的观察鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与鼠尾胶及联合对日本血吸虫培养细胞的促贴壁作用。方法灌注法获取21 d虫龄的日本血吸虫虫体,冷消化法制备细胞悬液,调细胞数为1×109／L,并将细胞分别接种于预先铺敷鼠尾胶(鼠尾胶组)、MEF(MEF组)、铺敷鼠尾胶后接种MEF(联合组)和既不铺敷鼠尾胶也不接种MEF(对照组) 的4组培养瓶中培养,培养基为RPMI-1640含20％小牛血清附加常量抗生素。定时计数贴壁细胞数,计算贴壁率。结果随着培养时间从24-48 h,各组日本血吸虫细胞的贴壁率逐渐增高,48 h以后贴壁率开始下降;方差分析显示,同组内不同培养时间细胞贴壁率比较,差异有统计学意义(F=149．22、81．97、232．86、63．05,P<0．01);q检验发现,同组内不同培养时间两两比较差异有统计学意义(P<0．01)。相同培养时间,各组间培养细胞的贴壁率不都相同 (F24=44．65,P<0．01;F48=1 071．489,P<0．01;F72=4 208．35,P<0．01);q检验分析显示,除培养24 h的MEF组与鼠尾胶组细胞的贴壁率差异无统计学意义外(q=0．792,P>0．05),其余两两比较均有统计学意义(P<0．01)。结论 MEF对日本血吸虫培养细胞的贴壁具有促进作用,MEF与鼠尾胶联合对培养细胞的贴壁具有协同作用。     

雄虫抽提物对日本血吸虫卵黄培养细胞最适浓度的筛选

目的筛选雄虫抽提物对日本血吸虫卵黄培养细胞影响的最适作用浓度。方法灌注法获取28 d虫龄的日本血吸虫虫体,无菌处理后分离雌雄虫体。将雄虫匀浆,反复冻融3次,离心取上清液,考马斯亮蓝法测定蛋白后置于-20℃下保存备用。切下雌虫卵黄腺段虫体,冷消化法制备细胞悬液,调整细胞数为1×10~9/L后,将卵黄细胞接种于小盖玻片上,RPMI-1640含20%小牛血清培养,根据加入不同质量浓度雄虫抽提物分为6组(0、10、50、100、150、200mg/L组)。培养第7天,以核仁组织区相关嗜银蛋白(argyrophilic nucleolar organizer region associated proteins,AgNORs)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为评价指标,对卵黄细胞进行AgNORs及LDH染色,Olympus-BH2显微镜观察,输入HPIAS-2000图像分析仪测定培养细胞的灰度值。结果随着雄虫抽提物质量浓度的增加,培养细胞的AgNORs与LDH着色均逐渐加深,至100 mg/L时最深,随后又逐渐变浅。图像分析显示,雄虫抽提物处理的各组细胞AgNORs及LDH均明显高于对照组(q_(10)=14．2189、q_(50)=18．3358、q_(100)= 35．6491、q_(150)=13．1849、q_(200)=13．8604,P＜0．01；q_(10)=10．3377、q_(50)=11．7532、q_(100)=23．1883、q_(150)=10．2792、q_(200)= 9．3052,P＜0．01)。雄虫抽提物100 mg/L组与其他各组比较,AgNORs及LDH明显升高(q_(10)=21．4302、q_(50)= 17．3132、q_(150)=22．4642、q_(200)=21．7887,P＜0．01；q_(10)=12．8506、q_(50)=11．4351、q_(150)=12．8896、q_(200)=13．8831,P＜0．01)。结论雄虫抽提物可显著提高日本血吸虫卵黄细胞的增殖能力与代谢活性,其作用的最适质量浓度为100 mg/L。