人羊膜细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

人羊膜细胞（HEACs）源自于受精卵第八天时成羊膜细胞，具有细胞来源充足，不表达HLA抗原，移植不引发免疫排斥的优点。另外羊膜细胞具有表达神经细胞和神经胶质细胞标志物的细胞以及其能分泌神经递质和营养因子的特性更利于神经移植。因此作者采用移植人羊膜细胞来治疗大鼠脊髓损伤，观察其是否对改善功能确实有益。     

人羊膜细胞与创伤性脑组织提取液共培养的实验研究

目的 探究将人羊膜细胞(HACs)置于创伤性脑组织提取液的条件培养基中,模拟HACs在创伤性脑损伤微环境下的分化和增殖情况,为HACs脑内移植提供基础研究.方法 取无并发症剖官产羊膜,用0.25%胰酶反复消化3次提取HACs,接种后48h去除未贴壁的HACs.采用改进的Feeney法制作大鼠创伤性脑损伤(TBI)模型,TBI 24 h后制备创伤性脑组织提取液.将HACs分别接种于RPMI 1640培养基(1640)、RPMI 1640培养基与正常脑组织提取液(1640 NB)、RPMI 1640培养基与创伤件脑组织提取液(1640 TBI)3组.共培养7 d后HE染色显微镜下检测各组细胞形态.培养前后分别行Nestin和MAP-2单抗免疫组化检测.将HACs以104/ml密度分别接种上述3种培养基,培养后1、4和7 d经酶联免疫检测仪行四氮唑盐(MTT)比色法检测各组HACs活性.结果 1640组HACs呈圆形或椭圆形,核大居中;1640 TBI组部分HACs形态出现锥形、三角形等神经元样改变.HACs培养前可见Nestin阳性细胞,培养后1640 TBI组可见MAP-2阳性表达.各组HACs增殖性均不佳.结论 HACs与创伤性脑组织提取液共培养后可转化为神经元样细胞.HACs增殖性不佳.     

hNIS/TK基因共转染介导131I/GCV对肝癌细胞株的毒性作用

背景与目的:与传统的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)肿瘤自杀系统相比,人钠/碘同向转运体(human sodium-iodide symporter,hNIS)是近年来发现的新型治疗基因.然而,两者的疗效尚需进一步提高.本研究旨在探索hNIS介导的放射性核素体系与HSV-TK/GCV自杀基因体系对肝癌细胞的联合毒性作用.方法:构建EF1-a启动子调控下的hNIS的表达载体与CMV启动子调控下的GFP和HSV-TK共表达载体,慢病毒包装后转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察重组肿瘤细胞HepG2/NTG荧光蛋白的表达;采用RT-PCR技术进一步检测目的基因hNIS和HSV-TK的表达情况;MTT检测GCV对HepG2/NTG的杀伤作用;摄碘试验及流出试验评价HepG2/NTG对碘的摄取及滞留情况;最后通过克隆形成实验评价GCV和131I对HepG2/NTG的单独及联合杀伤作用.结果:RT-PCR技术、荧光显像证实hNIS、GFP和HSV-TK基因在肝癌细胞中成功表达;与对照组相比,HepG2/NTG的摄碘高出76倍,20 min摄碘率最高,其后表现出碘外流,有效半衰期不到10 min,同时这种碘摄取能被NaClO4特异性抑制.GCV或131I对HepG2/NTG的毒性作用呈现剂量依赖性:50μg/mL GCV作用72 h后,实验组细胞的存活率仅为(33.98±2.71)%;放射性浓度为7.4MBq/mL的131I处理7 h后,细胞的存活率仅为(41.17±0.72)%;GCV和131I联合作用后,细胞的存活率仅为(8.55±1.22)%,较单一药物作用细胞存活率下降了6倍.结论:131I/GCV对重组肝癌细胞产生显著的毒性作用,提示慢病毒介导hNIS/TK基因共转染介导肿瘤的放射化学治疗是可行的.     

缺血性脑损伤后大鼠脑中脂质体介导外源基因的表达

目的 探讨在短暂、局灶性脑缺血后，脂质体介导的外源基因能否在大鼠脑组织中有效的表达。方法 将大鼠—侧大脑中动脉栓塞1h以制作短暂、局灶性脑缺血模型。根据行为实验来判定模型制作是否成功。将含报告基因LacZ的质粒和脂质体的复合体注入实验组大鼠的脑脊液中，对照组只注射脂质体。7d后取动物脑组织，通过组织化学和逆转录酶—多聚酶链反应(RT—PCR)等方法来鉴定外源基因是否表达。结果 转染LacZ基因的缺血性脑损伤大鼠脑组织中，其表达产物β—半乳糖苷酶在皮质、皮质下区域的细胞及脉络丛中均呈阳性表达；在缺血中心区域，表达β—半乳糖苷酶的细胞数很少；在缺血周边区域，表达β—半乳糖苷酶的细胞数较多；而非缺血区域表达β—半乳糖苷酶的细胞明显较缺血中心区域为多；其脑组织中LacZ mRNA在RT—PCR实验中亦呈阳性。只注射脂质体的缺血大鼠脑组织中，β—半乳糖苷酶和LacZ mRNA的检测均为阴性。结论 缺血性脑损伤发生后，脂质体介导的外源基因可在脑组织中有效表达。脂质体介导的基因转染可能是治疗缺血性脑损伤的一种有效方法。     

高表达FasL的Sertoli细胞在睾丸局部感染时的免疫调节作用

目的：研究高表达FasL的转基因小鼠Sertoli细胞在睾丸局部感染时的免疫调节作用。方法：以溶脲脲原体（Ureaplasma urealyticum,UU)直接注入FasL转基因的小鼠膀胱模拟上行性感染的途径，分别在1、2和3周处死小鼠，分离取得睾丸组织，观察组织的病理变化，并从小鼠睾丸组织分离获得高纯度的Sertoli细胞，然后抽提总RNA，用RT－PCR方法比较正常组与UU感染组之间FasL、IL－1α、TGF－βmRNA的表达差异。结果：与正常组相比，UU感染的小鼠，睾丸组织发生明显的病理改变，Sertoli细胞表达的调节因子在mRNA水平也发生了明显的变化：其FasLmRNA的表达在1周，3周时与正常无明显区别，2周时明显升高；IL－1α、TGF－βmRNA的表达在1－3周均为升高。结论：FasL转基因小鼠的睾丸ertoli细胞可通过改变有关细胞因子的表达格局发挥免疫调节作用。     

转导人TIMP-2基因抑制胃癌浸润转移的实验研究

目的外源性人ＴＩＭＰ－２基因在人ＬＡＫ细胞中的表达及其对胃癌浸润转移的抑制作用。方法通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀的方法将ＴＩＭＰ－２重组真核表达质粒ｐＬ（ＴＩＭＰ－２）ＳＮ转染兼性包装细胞ＰＡ３１７包装形成病毒颗粒。用病毒液感染人ＬＡＫ细胞,再以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及反向酶谱试验进行表达及活性分析。用转基因ＬＡＫ细胞（ＬＡＫ／ＬＴ）２×１０６给胃癌转移模型腹腔内注射。结果ＴＩＭＰ－２在ＬＡＫ／ＬＴ中ｍＲＮＡ高度表达,在ＬＡＫ中弱表达。ＬＡＫ／ＬＴ细胞中有相对分子质量２１０００大小的蛋白质表达,具抑制Ⅳ型胶原酶降解明胶的活性。肿瘤种植后１０周,对照组肿瘤体积为（４．００±１．７０）ｃｍ３,肝转移率和腹膜转移率均达１００％,脾脏转移率为７０％（ｎ＝１０）;单用ＬＡＫ细胞治疗组肿瘤体积为（２．７２±１．２０）ｃｍ３,肝及腹膜转移率分别为６０％和７０％;ＴＩＭＰ－２高表达的ＬＡＫ／ＬＴ细胞治疗组肿瘤体积仅（１．２１±１．１６）ｃｍ３,肝转移率与腹膜转移率仅分别为２０％和３０％。肿瘤生长抑制率达７０％,肝及腹膜转移抑制率分别为８０％和７０％。结论ＴＩＭＰ－２对胃癌生长及转移具有抑制作用。     

联合转染A20、HO-1基因对大鼠胰岛抗凋亡能力影响的研究

目的 研究A20基因、血红素加氧酶1基因(heme oxygenase 1 gene,HO-1)转染在大鼠胰岛细胞中的表达情况及对体外培养条件下胰岛活性、拮抗放线菌酮(CHX)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的胰岛细胞凋亡作用的影响.方法 构建A20、HO-1和增强绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒转移载体,荧光显微镜连续观察EGFP表达情况,评估转基因效率、确定诱导凋亡时机.Western印迹测定A20和HO-I蛋白表达.超敏ELISA试剂盒检测胰岛素浓度.胰岛经CHX+ TNF-α处理48 h进行TUNEL、流式细胞仪检测凋亡率.Western印迹检测半胱氨酸蛋白酶-3的活化.结果 (1)分别以A20和HO-1慢病毒转染胰岛检测表明A20和HO-1蛋白均呈高表达.(2)胰岛细胞经培养48h和96 h,转基因各组胰岛素浓度高于空白对照组(P＜0.01).(3)CHX+ TNF-α诱导胰岛细胞凋亡后,转A20组胰岛素浓度为(93.58 ±4.12) μg/ml、转HO-1组胰岛素浓度为(88.98±4.77) μg/ml,联合转A20和HO-1组胰岛素浓度(103.33 ±3.16) μg/ml,均高于转EGFP组[(9.03±0.65) μg/ml]和空白对照组[(8.86±0.38) μg/ml,P＜0.001].Western印迹法检测显示联合转A20/HO-1基因组活化型半胱氨酸蛋白酶-3表达水平最低.结论 原代胰岛细胞中高效表达的A20和HO-1蛋白具有抗CHX+ TNF-α诱导的胰岛凋亡作用,联合转A20和HO-1基因有协同抗凋亡效应.     

Effects of recombinant human growth hormone (r-hGH) on experimental osteoporotic fracture healing

ＴＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ,ＮｉｎｔｈＰｅｏｐｌｅ ｓＨｏｓｐｉｔａｌ,ＳｈａｎｇｈａｉＳｅｃｏｎｄＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ,Ｓｈａｎｇｈａｉ 2 0 0 0 11,Ｃｈｉｎａ(ＨａｏＹＱ ,ＤａｉＫＲ ,ＧｕｏＬＨ ,ＷａｎｇＹＪａｎｄＴａｎｇＴＴ)ｈｅｍａｊｏｒｈａｒｍｔｏｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｉｓｆｒａｃｔｕｒｅ .Ｂｕｔｌｉｔｔｌｅｈａｓｂｅｅｎｋｎｏｗｎａｂｏｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｏｓｔｅｏｐｏｒｏｔｉｃｆｒａｃｔｕｒｅｈｅａｌｉｎｇｓｏｔｈａｔｃｕｒａｔｉｖｅｅ…     

人生长激素拮抗剂对糖尿病小鼠肾病的干预作用

目的探讨人生长激素拮抗剂(GHA,又称生长激素受体拮抗剂)对糖尿病小鼠肾病的干预作用.方法雄性C57BL小鼠共39只,分为正常对照组、糖尿病(DM)对照组、GHA1组、GHA2组和人生长激素(hGH)组,链脲佐菌素诱发糖尿病,后三组分别注射GHA1、GHA2和人生长激素(hGH)为期11周.观察各组小鼠体重、肾脏形态和尿蛋白排泄情况.结果DM对照组、hGH组和二种GHA组小鼠体重增长差异无显著性.hGH组肾小球面积(4289±798)μm2和小球内细胞数(37.4±5.5)显著高于其他各组,二种GHA组肾小球面积和GHA2组小球内细胞数与正常对照组差异无显著性,各糖尿病组系膜区PAS阳性物质沉积差异无显著性.hGH和DM组尿蛋白排泄与GHA组相比差异无显著性.结论hGH可加重DM小鼠肾小球的肥大和小球内细胞增生,皮下注射GHA对预防糖尿病小鼠肾小球肥大、小球内细胞增殖及保持肾小球形态的完整性有一定作用.     

人类神经前体细胞大鼠胎脑内移植研究

目的探讨人类神经前体细胞大鼠胎脑侧脑室内移植后的移行和分布。方法采用机械方法从胎脑中分离神经细胞,应用N2培养基进行培养,细胞用携带LacZ基因的腺病毒或BrdU标记,移植到孕期为16~18d的胎鼠侧脑室内,检查出生后不同时期脑组织中移植细胞的分布和移行。结果成功培养出人类的神经干细胞,细胞聚集形成神经球,呈悬浮状态,大部分细胞表达神经前体细胞的标志物巢蛋白,这种细胞能够分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞在体内和体外可以稳定表达外源性基因,移植到胎鼠脑内,人类胚胎神经前体细胞广泛移行并分布于宿主的脑组织中,结合到大鼠的前脑、中脑和后脑,形成广泛的嵌合现象。结论神经干细胞可以稳定表达外源性基因,移植到发育期的脑内,能够整合到脑组织中,形成广泛的嵌合现象。