新型小分子抗体scFv多聚体与肿瘤靶向

新型小分子抗体一单链可变区片段(scFv)是由一弹性接头(linker)将VH和VL连接而成，是抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位。以分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。依据接头的长度和V区的方向，scFv分子可聚集形成二聚体(Diabody)、三聚体(triabody)和四聚体(tetrabody)。我们就scFv分子接头长度和V区方向、scFv多聚体的表达和稳定性、scFv多聚体在体内的药代动力学、scFv多聚体的弹性和亲和力、鼠源性scFv多聚体的体外应用、多特异性ScFv多聚体与肿瘤靶向几个方面作一综述。     

靶向脐带间充质干细胞的构建及在小鼠脾脏的定位研究

目的：构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体,用携带P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC,使MSC具有靶向性,将靶向MSC注入小鼠体内后观察MSC在小鼠脾脏的定位及与淋巴细胞的关系。方法：用组织片贴壁法培养健康人脐带间充质干细胞,用基因工程技术构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体并感染人脐带间充质干细胞,通过尾静脉将转入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠体内,18小时后免疫组化染色观察GFP在小鼠脾脏的定位。结果：培养的健康人脐带间充质干细胞生长良好,MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18小时后MSC开始出现绿色荧光,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐增强,72小时达高峰。靶向MSC表达髓系干细胞的表面标记 CD105（90.0%）/CD44（98%）,CD73（85.0%）/ CD90（98.5%）。将靶向MSC经尾静脉注入小鼠体内, 18小时后小鼠脾脏出现大量GFP阳性细胞,并与脾脏淋巴细胞密切接触。结论：本研究成功构建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC,靶向MSC成功定向脾脏,并与脾脏淋巴细胞密切接触,可用于后续的实验研究。     

重组蓖麻毒素A链的融合表达、纯化及活性研究

目的: 制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA)。方法: 在RTA序列的C末端引入KDEL信号肽,克隆到含有硫氧还蛋白(Trx)的融合表达载体pET32a中, 转入大肠杆菌BL21, 在低温 ( 20℃)下用低浓度 ( 0. 4mmol/L)IPTG诱导重组质粒进行表达。表达上清用钴离子亲和层析柱进行纯化, 20~100mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白。纯化蛋白经SDS- PAGE电泳与Westernblot鉴定后, 对pUC19质粒进行超螺旋dsDNA裂解研究。结果: 每升细菌培养物回收约60mg的纯化蛋白, 纯度大于 90%, Mr约 45 000, 且 3μg纯化蛋白即可以对 1μg超螺旋dsDNA产生明显的裂解活性。结论: 利用pET32a表达系统可以快速获得大量有高生物活性的可溶性RTA- Trx融合蛋白。     

重组蓖麻毒素A链的原核表达和单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的 实现重组蓖麻毒素A链(rRTA)的高效表达,获得rRTA的单克隆抗体,建立基于单抗的蓖麻毒素检测方法.方法 用计算机辅助设计的RNA二级结构预测和偏性密码子等手段设计引物;用PCR将rRTA基因克隆至载体pE132a( );用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IFTG诱导rRTA原核表达载体pET32a( )/rRA/BL21,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Westernblot鉴定rRTA蛋白;rRTA免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株,获得抗rRTA的单克隆抗体,用Westem blot鉴定.结果 构建了rRTA原核表达载体pET32a( )/rRA/BL21,实现了rRTA在大肠杆菌BL21中的高效可溶性表达,获得了高纯度约10～20 mg/L rRTA;获得抗rRTA的单克隆抗体;建立的ricin EIJSA检测方法检出ricin的最低浓度为3.125 ng/mL,目视比色对蓖麻毒素的最低检出浓度为6.25 ng/mL.结论 本研究表达的rRTA及其单克隆抗体和基于单抗的ricin检测方法,将在肿瘤生物治疗、ricin生物恐怖袭击的侦检、治疗和预防中发挥重要作用.     

肝癌患者树突状细胞功能及状态的研究

目的 :评价肝癌患者体内树突状细胞的功能与状态 ,为肝癌DC疫苗的研制奠定基础。方法 :改进目前国内外普遍使用的DC诱导方法 ;用改进后的DC诱导方法 ,诱导肝癌患者DC ,检测DC表面各种分子的表达及其诱导同种异体淋巴细胞转化的能力和DC培养上清中TNF和IL - 1 2水平。结果 :经GM -CSF和IL - 4联合诱导 ,平均从 1 0 0ml健康人外周血中诱导出 9.7× 1 0 6 个DC ,诱导出 9.2× 1 0 6 个CD83+ 成熟DC ,CD83分子表达明显高于国内报道 ;健康人DC诱导同种异体淋巴细胞转化的能力高于肝癌患者 ,但肝癌患者和健康人DC培养上清中IL - 1 2含量几乎没有差别 ,反而肝癌患者DC培养上清中TNF水平高于健康人。结论 :肝癌患者自身的DC仍具有一定的抗原呈递能力 ,适当调控有可能使其行使APC功能 ,可望在肝癌个体化疫苗中发挥作用     

血培养中病原菌的分布及耐药性分析

1材料和方法1.1材料①菌株:来自我院2002年11月~2005年12月间的临床送检的血培养1884份,其中阳性者中265例采用K-B法进行药敏试验,ATCC25722大肠埃希菌和ATCC25923金黄色葡萄球菌及ATCC27853铜绿假单胞菌作为质控菌。②仪器:BacT ALERT3D全自动血培养仪(法国Bio Merieux公司)③     

survivin蛋白的原核高效、可溶性表达及其抗体在恶性肿瘤早期诊断中的应用

目的 实现重组survivin在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,检测健康人和肿瘤患者血清中anti-survivin并探讨其在肿瘤早期诊断中的应用价值.方法 重组PET32a-survivin质粒转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达8 h后对表达产物行溶菌酶处理、冻融及超声处理,SDS-PAGE及Western blot鉴定后用镍离子金属螯合层析柱纯化.建立基于重组融合蛋白的survivin特异性抗体的检测方法,对300份健康血清、144份肿瘤血清anti-survivin进行了检测,并将anti-sur-vivin与肝癌、肠癌、胰腺癌、卵巢癌患者中AFP、CEA、CA199、CA125等肿瘤标志物进行了联合分析.结果 重组survivin融合蛋白在BL21中获得了高效、可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的30%.建立了检测survivin抗体的间接ELISA方法,anti-survivin在不同的肿瘤血清中均有表达,阳性率各不相同.结论 成功的实现了survivin蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达;结果提示在肿瘤的辅助诊断中,anti-survivin与现有的肿瘤标志物CA199、CEA、CA-199和CA-125联合检测,可以互相补充其不足,提高肿瘤的诊断率.     

临床微生物实验室实行标本负责制的体会

目的提高临床微生物实验室的检验质量,及在传染病流行、医院感染及耐药菌株控制及应对方面的能力。方法通过优化流程,实行标本负责制;密切联系临床;以人为本,提高工作效率;作好质量控制和完善信息系统5个方面进行了探讨。结果提高了检验工作效率和质量,避免了出现问题时的扯皮和推卸责任。结论满足了临床对微生物实验室的需求,同时也提高了检验人员的地位,达到了双赢。     

树突状细胞负载肝癌相关抗原后成熟调控的研究

目的 研究树突状细胞（DC）负载肝癌相关抗原后的成熟调控。方法 用SDS－PAGE制备电泳纯化牛结核分枝杆菌热休克蛋白70，用其诱导DC的分化与成熟。结果 DC负载肝癌可溶性抗原后，10％2细胞失去了DC特征，同时其表面CD54（90．0％），CD83（78．0％），CD86（85．0％）分子表达下降；牛分枝杆菌卡介苗－热休克蛋白70（BCG HSP70）的活化有利于负载肝癌可溶性抗原后的DC维持其特异性标志，同时DC表面CD54（92．0％），CD83（90．0％），CD86（91．0％）分子表达增加，DC诱导同种异体淋巴细胞转化的能力增加，淋巴细胞增殖加快，从而促进DC成熟，增加其抗原呈递能力。结论 预示BCG HSP70有可能成为促进DC活化和成熟的另一重要分子。     

HSP—肿瘤免疫的分子佐剂

肿瘤疫苗研制中存在的一个主要问题便是大多数肿瘤的免疫原性很弱，不能正常的呈递抗原以激活CTL，为了提高其免疫原性，必须加入佐剂。不幸的是人用疫苗遇到的最大障碍便是缺乏能发挥最佳效应的佐剂，因此开发研制新一代人用性剂势在必行。本文根据HSP研究的最新进展，就HSP增强肿瘤免疫原性及其在免疫应答中发挥分子佐剂功能的可能途径作一综述。