细胞穿透肽PEP-1介导人过氧化氢酶转导入在体大鼠心肌组织

目的：观察PEP-1介导CAT转导人心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性．方法：用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白．以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0．5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光及Western Blot检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性．结果：SDS—PAGE和Western Blot证实目的蛋白PEP-1-CAT和CAT得到了高表达,且纯度在90％左右．生理盐水组及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光,Western Blot亦未检测到目的蛋白;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大,同时Western Blot也检测到了目的蛋白,8h时量最多;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别无统计学意义,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4．20倍．结论：PEP-1能够介导CAT以天然活性方式转导入大鼠心肌组织,且其转导呈时间依赖性．     

PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察细胞穿透肽PEP-1介导CAT转导入在体大鼠心肌组织的能力,探究PEP-1-CAT融合蛋白对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μgPEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性。40只SPF级雄性SD大鼠,随机分为5组,假手术组,心肌缺血再灌注组,100μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组,300μgEP-1-CAT融合蛋白预处理组,500μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组。结扎冠状动脉前降支1h,再灌注2h末,检测血中的LDH和CK活性以及心肌组织内的MDA含量。结果生理盐水组以及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别没有统计学意义（P〉0.05）,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4.20倍。PEP-1-CAT各剂量组均能显著减少血清中LDH和CK活性和心肌组织的MDA含量（P〈0.01）。结论PEP-1能够介导CAT以时间依赖的方式转导入在体大鼠心肌组织,转导入大鼠心肌组织内的CAT具有相应的酶活性;PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,为临床应用PEP-1-CAT融合蛋白防治心肌缺血再灌注损伤奠定了实验基础。     

VEGF通过细胞外信号调节激酶途径促进骨髓源间充质干细胞的增殖

本研究旨在探索血管内皮生长因子(VEGF)对间充质干细胞(MSC)增殖的影响及其可能的机制。采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞术分析其表面标记(CD45、CD34、CD90、CD29)等鉴定MSC特征;以培养的第3代MSC(P3MSC)为实验材料,采用MTT法分析20ng/ml的VEGF作用12、36、72小时对MSC增殖的影响;随后以细胞外信号调节激酶(ERK1/2)阻断剂50μmol/L PD98059或丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)阻断剂30μmol/L SB203580等分别处理P3MSC,观察VEGF是否通过p38MAPK或ERK1/2途径影响MSC的增殖。结果表明:培养的P3MSC表达PDGFR-α、PDGFR-β和NRP1,不表达VEGF-R(Flk1和Flt1)。P3MSC呈现CD90(96.7%)和CD29(94.6%)强阳性以及CD34(0.79%)和CD45(0.84%)阴性特征,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;20ng/ml VEGF作用于MSC后,随着时间的延长,MSC增殖也逐渐增强,在72小时达峰值。在50μmol/L PD98059或30μmol/L SB203580处理后,VEGF所介导的MSC增殖效应被阻断,且在对照水平以下。PD98059阻断效应明显强于SB203580的阻断效应。结论:VEGF可能主要通过细胞外信号调节激酶途径调节MSC的增殖。     

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。     

PEP-1介导血红素加氧酶-1导入肝细胞的实验研究

目的采用体外培养的L02肝细胞株,研究PEP-1肽介导血红素加氧酶-1（PEP-1-HO-1）穿透肝细胞的能力。方法实验分为PEP-1-HO-1组和HO-1组,用基因工程的方法制备并纯化PEP-1-HO-1融合蛋白,将纯化的目的蛋白及HO-1蛋白加入培养的L02肝细胞,通过免疫荧光及western blot来分析其转导能力。结果经测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-HO-1重组成功。SDS-PAGE及western blot结果表明,PEP-1-HO-1在Rosetta（DE3）pLysS菌中获得了高效表达,经Ni2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,将其加入到体外培养的L02肝细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能持续稳定表达48h,免疫组化显示其主要分布于胞质和胞核中。结论 PEP-1-HO-1融合蛋白能高效地转导入培养肝细胞,为进一步研究肝细胞氧化应激损伤防治的动物模型实验提供了新的途径。     

进展期胃癌术后腹腔化疗的临床研究

198 7年 3月～ 1995年 10月我们对 30 1例胃癌患者术后进行联合腹腔化疗与单纯全身化疗的临床疗效观察 ,探讨腹腔化疗在进展期胃癌术后的治疗作用 ,现报告如下 :1　材料与方法1 1　一般资料　本组 30 1例 ,均为经手术病理确诊 ,无远处脏器转移的进展期胃癌患者。男 185例 ,女 1     

人基质细胞衍生因子-1对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:探索人基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对间充质干细胞(MSC)增殖的影响.方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD133,CD34,CD90,CD105)等鉴定MSC特征;以P3-MSC为实验材料,采用H3-TdR参入法分析SDF-1对MSC增殖的影响.以50 nmol/L渥曼青霉素,10mmol/L LY294002,50 mmol/L PD98059,0.1g/L AMD3100等分别处理P3-MSC,观察SDF-1影响MSC增殖的信号机制.结果:培养的MSC呈现出CXCR4,CD90和CDl05强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;含有100,ng/L SDF-1的20mL/L促进了MSC增殖,而含有100 mg/L SDF-1的150 ml/LFBS抑制了MSC增殖.SDF-1抑制MSC增殖的效应与其使MSC停滞在G1/S期有关.促分裂原活化蛋白激酶P38MAPK阻断剂SB203580和CXCR4阻断剂AMD3100取消了SDF-1抑制MSC增殖的效应,而细胞外信号调节激酶阻断剂PD98059加强了SDF-1抑制MSC增殖的效应.结论:SDF-1/CXCR4介导的抑制MSC增殖的效应与促分裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶等信号分子有关.     

hSDF-1α/CXCR4介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导

目的:利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移中的作用及其信号转导机制. 方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC, 通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD133,CD34,CD90,CD105)等鉴定MSC特征;以P3-MSC为实验材料,利用Boyden chamber体外迁移体系,观察不同浓度的hSDF-1对MSC迁移的影响,以50 nmol渥曼青霉素,10 mmol LY294002,50 mmol PD98059,10 mmol U73122,0.1 g/L AMD3100等不同处理P3-MSC,观察最适宜浓度的hSDF-1对MSC迁移影响的信号转导机制. 结果:培养的MSC呈现出CD90,CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;MSC体外迁移能力随着hSDF-1α浓度(1,10,100,500 μg/L)的递增而逐渐增强,并且hSDF-1α浓度在100 μg/L时,MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值;渥曼青霉素,LY294002,PD98059,U70312,AMD3100,维拉帕米对MSC迁移均有影响,其中U73122,AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著. 结论:SDF-1/CXCR4所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关, 且PKC途径可能处于中心环节.     

甘露醇对癌痛止痛效果临床观察

目的：通过临床应用甘露醇,观察其对１０８例恶性肿瘤疼痛的止痛效果及实用性。方法：ｉｖｇｔｔ２０％甘露醇２５０ｍｌ,随机分为ｑｄ组和ｂｉｄ组,对两组止痛效果进行比较;对恶性肿瘤放射治疗病例,分为单纯放射治疗组和放射治疗加ｉｖｇｔｔ甘露醇组,观察放射治疗引起４、５、６级疼痛出现率。结果：ｉｖｇｔｔ２０％甘露醇ｍｌ,ｑｄ和ｂｉｄ组,止痛效果ＣＲ分别为６８．５％和７０．６％（ｐ〉０．０５）;单纯放射治疗组     

PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人平滑肌细胞的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和人平滑肌细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的大分子抗平滑肌细胞增殖进行血管成形术后再狭窄的蛋白治疗奠定了基础。