淫羊藿苷对体外培养的成骨细胞骨形态发生蛋白-2表达的影响

目的:检测不同浓度淫羊藿苷(ICA)对体外培养的成骨细胞MC3T3-E1中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达的影响。方法:分别用10、20、40ng/mL的淫羊藿苷作用MC3T3-E1细胞,观察细胞生长情况;MTT法测绘细胞生长曲线;FCM法测定细胞生长周期;免疫细胞化学方法和Western bloting测定细胞BMP-2蛋白表达情况。结果:淫羊藿苷组可使细胞的生长曲线明显上移,S期细胞百分率升高,G1期细胞百分率减少以及BMP-2蛋白表达量增加,其中20ng/mL组作用更为显著,各组间比较有显著差异(P(0.01)。结论:淫羊藿苷可以促进成骨细胞增殖,增加成骨细胞BMP-2的表达。     

PEP-1-SOD1融合蛋白抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成

目的研究穿透肽(PEP-1)介导的铜-锌超氧化物歧化酶1(SOD1)(PEP-1-SOD1)融合蛋白对血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFbs)Ⅰ型胶原合成的影响,并探讨其机制。方法利用基因工程技术表达和纯化PEP-1-SOD1融合蛋白。提取原代大鼠CFbs并传代培养,采用2～5代细胞进行实验,实验分为对照组、ANGⅡ诱导组、SOD1预处理组和PEP-1-SOD1预处理组。SOD1预处理组和PEP-1-SOD1预处理组细胞分别以2μmol.L-1的SOD1和PEP-1-SOD1预处理2 h后,再给1μmol.L-1的ANGⅡ诱导24 h,用免疫荧光法检测细胞内超氧阴离子(O2-)水平,微量丙二醛(MDA)检测试剂盒检测各组细胞MDA含量。结果 Western blot和细胞免疫荧光结果显示PEP-1-SOD1成功穿透入CFbs;Western blot结果显示,与ANGⅡ诱导组比较,PEP-1-SOD1预处理组Ⅰ型胶原和α平滑肌肌动蛋白表达显著降低(P<0.01),细胞内O2-和MDA水平也显著降低(P<0.01)。结论 PEP-1-SOD1融合蛋白穿透入大鼠心脏CFbs内,通过降低细胞内O2-水平,抑制CFbs的激活,减少Ⅰ型胶原的合成。     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

PEP-1肽介导入过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的：采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株（CRL-1730），研究PEP-1肽介导入过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法：构建原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT，将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”（His—tag）的重组蛋白，并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化，然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞，通过Western　blot来分析其转导能力。结果：测序分析证实，原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT重组成功。SDS—PAGE和Western blot结果表明，PEP-1-CAT在E．coli中获得了高效表达，经Ni^2＋ -NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT，并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性，活性值为77．1U／g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中，发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内，并能保持酶活性达48h。结论：PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞，为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

碱性成纤维细胞生长因子对间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对间充质干细胞(MSCs)增殖的影响及其信号机制。方法:全骨髓贴壁法培养MSCs,流式细胞仪分析其表面MSCs标记(CD45、CD34、CD90、CD29)以及成骨、成脂肪等多向诱导分化潜能,鉴定其特征。MTT法分析不同浓度bFGF对MSCs增殖的影响,确立最佳浓度bFGF诱导MSCs增殖的时间特征,分别以磷脂酰肌醇3-激酶、促分裂素原活化蛋白激酶、磷脂酶C、蛋白激酶C、钙通道和钙泵选择性抑制剂等处理P3MSCs后,观察其对bFGF介导MSCs增殖的影响。结果:培养的MSCs表现CD90、CD29强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;bFGF诱导MSCs增殖呈时间和剂量依赖特征,5.4×10-4mol/L bFGF作用48 h时MSCs增殖达峰值;磷脂酶C阻断剂U73122、钙通道阻断剂和选择性蛋白激酶C阻断剂等明显抑制了bFGF所介导的MSCs增殖效应;尤其是非选择性PKC抑制剂Straurosporine、钙泵选择性抑制剂thapsigargin以及蓝尼定受体抑制剂Ryandoine均抑制bFGF所诱导的MSCs增殖。结论:bFGF通过Ca2+/PKC/Erk1/2途径促进MSCs的增殖。     

小檗碱对兔颈动脉血管成形术后再狭窄的影响

目的:通过观察小檗碱对球囊损伤后兔颈动脉内膜增生与血管重塑的影响,为血管成形术后再狭窄的防治寻找新的治疗策略。方法:日本大耳白兔40只,随机分为假手术组、模型组、小檗碱组和辛伐他汀组,除假手术组外各组均以球囊导管扩张损伤颈动脉内膜,并分别给予生理盐水、小檗碱和辛伐他汀各2.5 mg/(kg.d)腹腔注射,假手术组仅普食喂养。术后15 d取损伤颈动脉段切片,作形态学观察,利用图像分析系统测量血管新生内膜厚度(IT)、管腔面积(LA)、新生内膜面积(IA)、内弹力板围绕面积(IEL)、中膜面积(MA)、外弹力板围绕面积(EEL)。结果:血管球囊损伤后,小檗碱组和辛伐他汀组IT、IA、IA/MA均显著小于模型组(P<0.01)。与模型组相比,小檗碱组和辛伐他汀组LA、IEL、EEL均显著增大(P<0.01),MA则无显著性差异。结论:小檗碱可通过抑制兔颈动脉新生内膜增生与不良的血管重塑,从而为小檗碱防治血管成形术后再狭窄提供了实验基础。     

细菌内同源重组法构建pAd-EGFP-hSDF-1α腺病毒质粒

目的:利用细菌内同源重组法构建和制备含人基质细胞源衍生因子-1α(hSDF-1α)重组腺病毒质粒。方法:设计5'端分别具有EcoR V/Xho I酶切位点的扩增hSDF-1αcDNA片段上下游引物,聚合酶链反应法(PCR)从pORF-hSDF-1α质粒中扩增hSDF-1α的cDNA,插入pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-T-hSDF-1α质粒,EcoR V/Xho I双酶切后回收279 bp片段,与经过相同酶切的8.8 kb pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,连接产物转化感受态DH5α,挑选克隆,重组质粒pShuttle-EGFP-hSDF-1α用EcoR V/Xho I酶切鉴定。pShuttle-EGFP-hSDF-1α经Pm e I酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α;pAd-EGFP-hSDF-1α质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果:线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了279 bp的片段。结论:用细菌内同源重组成功地构建了含hSDF-1αcDNA的重组腺病毒质粒,为进行表达hSDF-1α的重组腺病毒的制备及hSDF-1α在骨髓源干细胞动员迁移中的作用研究奠定了基础。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

红细胞生成素对骨髓源间充质干细胞迁移的影响

目的 利用Transwell体外迁移体系初步探索EPO在骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移中的作用及其信号传递机制.方法 采用经典的全骨髓细胞贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞术分析其表面标志(CD133、CD34、CD90、CD105)等鉴定MSC特征;以第3代MSC为实验材料,利用Transwell体外迁移体系,先观察不同浓度的rhEPO对MSC迁移的影响,随后在50 nmol/L Wortmannin、50μmol/L PD98059、10μmoL/L U73122、4μg/ml抗EPO-R IsG、30 μmol/LSB203580、10 mmol/L Straurosporine、6 nmol/L G0697、50 μmol/L Pseudo Z等不同的信号转导途径阻断剂的干预下观察EPO对迁移的影响.结果 培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;MSC体外迁移能力随着rhEPO浓度(1、10、100、1000 IU/ml)的递增而逐渐增强,并且rhEPO浓度在100 U/ml时,MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值;Wortmannin、PD98059、抗EPO-R IgG、Straurosporine、G06976、Pseudo Z对MSC迁移均有影响,其中U73122、抗EPO-R IgG、Straurosporine、Pseudo Z对MSC迁移阻断的效应最显著.结论 EPO-EPO-R所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C-ζ(PKC-ζ)等信号传递途径有关,且PKC-ζ途径可能处于中心环节.