PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒

目的:将PCR扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基,使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。EcoRⅠ酶切质粒pHCM-Vsp1A-heNOS,回收heNOS cDNA作为模板,进行PCR扩增。将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为8∶1比例混和,在重组酶作用下,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上,获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定。结果:经鉴定,成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段,利用PCR产物靶向克隆法,可快速、高效完成PCR产物的定向克隆。     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

甘露醇对癌症患者止痛效果观察

中晚期肿瘤病人2/3以上有不同程度的疼痛。在严重疼痛中有1/3发生在治疗过程中。我们从1994年8月至1996年5月选择了22例有剧痛患者,应用20％甘露醇进行了治疗观察,取得了较好效果,报告如下。 1 临床资料 1.1 一般资料 22例有剧痛癌症患者,男性20例,女性2例。最大年龄72岁,最小年龄18岁,平均年龄58.2岁。其中肺癌12例,骨癌3例,食管癌3例(其中术后2例),胃癌2例(其中术后1例),肝癌2例。 1.2 疼痛的定量 按行为疼痛测定法、六点行为评分法判定:①无疼痛;②有疼痛,但可以被轻易忽视;③有疼痛,无法忽视,不干扰日常生活;④有疼痛,无法忽视,干扰注意力和日常生活;⑤有疼痛,所有日常生活都受     

骨髓间充质干细胞分泌基质细胞衍生因子1保护心肌细胞

背景：有研究显示表达CXCR4的干细胞能够沿着基质细胞衍生因子1的浓度梯度迁移到心肌梗死部位再生心肌和血管而改善心脏的功能。目的：探索间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子1对心肌细胞的保护作用。方法：收集培养2d的间充质干细胞条件培养基。在缺氧条件,利用基质细胞衍生因子1受体CXCR4阻断剂AMD3100或P13．K／Akt途径阻断剂LY294002预处理H9C2细胞后,利用AnnexinV／PI双标法流式细胞术分析间充质干细胞条件培养基作用下H9C2细胞凋亡的变化;Western blotting分析H9C2细胞磷酸化Akt蛋白的表达;RT-PCR分析间充质干细胞基质细胞衍生因子1的表达。结果与结论：RT-PCR结果显示间充质干细胞表达基质细胞衍生因子1,Westernblotting结果显示间充质干细胞条件培养基增加了H9C2细胞磷酸化Akl蛋白的水平。AnnexinV／P1分析发现间充质干细胞条件培养基明显降低了H9C2细胞缺氧复氧后的凋亡,且这种抗凋亡作用能被CXCR4阻断剂AMD3100或P13-K／Akt途径阻断剂LY294002所阻断。说明间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子1通过激活P13-K／Akt途径保护H9C2细胞,增加H9C2细胞的幸存能力。     

PEP-1-SOD1融合蛋白预处理对大鼠骨髓间充质干细胞在缺氧无血清条件下的保护作用

目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的能力及其在缺氧无血清条件下对MSCs的保护作用。方法:将纯化后的SOD1和PEP-1-SOD1蛋白分别加入到培养及鉴定后的第3代MSCs中,免疫荧光法和Western blot分析PEP-1-SOD1穿透入MSCs的变化,黄嘌呤氧化酶法分析其SOD酶活性。将2.5μmol/L PEP-1-SOD1预处理MSCs 45 min后去除PEP-1-SOD1,缺氧无血清条件下再处理24 h,Annexin V/PI双染标记,流式细胞术分析MSCs凋亡情况。结果:PEP-1-SOD1融合蛋白可以转导入MSCs,呈时间和剂量依赖性分布于胞浆和胞核,缺氧无血清条件下MSCs凋亡率明显降低(P<0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白可以高效、稳定转导入MSCs,并对缺氧无血清所诱导的MSCs凋亡具有显著保护作用。     

间充质干细胞通过旁分泌效应激活心脏干细胞迁移(英文)

目的:探索移植到心梗部位的间充质干细胞是否通过其旁分泌效应促进心脏干细胞迁移至心梗部位。方法:间充质干细胞(MSC)特征经流式细胞术鉴定其表面标志物特征及多向诱导分化实验确认其干性。经体外Transwell分析心脏干细胞迁移特征,利用VEGF,HGF及SDF-1α等受体特异阻断剂观察其在心脏干细胞迁移中的作用。在体利用左冠状动脉前降之结扎法复制心肌梗死模型。心梗后7 d,植入MSC到心梗及周边部位。细胞移植7 d后,流式细胞术分析其外周血中c-kit阳性的干细胞含量,免疫荧光组织化学技术分析心梗部位c-kit阳性的干细胞数目,同时行Western Blot分析心脏VEGF,HGF及SDF-1α的表达,一月后心导管技术测量心功能及胶原染色和HE染色确定梗死面积。结果:移植的MSC增加了心梗部位VEGF,HGF及SDF-1α的表达,并动员c-kit阳性的干细胞迁移至心梗部位。与对照组相比,MSC移植组明显降低了心梗面积,显著增加了血管密度,明显改善了左室心脏功能。体外迁移实验发现MSC条件培养基能够诱导心脏干细胞迁移,这个过程能被VEGFR、CXCR4及c-Met等受体特异阻断剂所阻断,且c-Met可能起主要作用。结论:移植的MSC通过其旁分泌效应激活c-kit阳性的干细胞迁移至心梗部位修复受损的心脏。     

胃供血动脉化疗灌注加栓塞动物实验病理研究

胃癌发病率居国内常见恶性肿瘤首位,中晚期胃癌缺乏有效治疗方法。经胃供血动脉化疗灌注(GAI)、能取得近期疗效,然生存期延长不理想。胃供血动脉栓塞(GAE)和动物实验病理研究虽有少数报道。尚未求得共识。我们对成年健康家犬进行了GAI后即行GAE的病理研究,旨     

基于保护动机理论的健康教育对维持性血液透析病人高磷血症的预防研究

[目的]探讨基于保护动机理论的健康教育对维持血液透析病人疾病知识及高磷血症的预防。[方法]将84例行维持血液透析病人根据随机数字表分为观察组和对照组各42例,观察组血液透析期间应用健康教育,对照组血液透析期间行常规性护理,比较两组病人自护能力及血液透析知识知晓率、治疗依从率、高磷血症发生率、满意率情况。[结果]观察组干预后自我效能总评分、健康知识、自我护理技能、自我概念、自护责任感评分显著高于对照组(P0.05)。观察组血液透析知识知晓率、治疗依从率、满意率高于对照组(P0.05),而高磷血症发生率低于对照组(P0.05)。[结论]基于保护动机理论的健康教育能有效提高维持血液透析病人自护能力及疾病知识知晓率,降低高磷血症发生率。     

中药肺痨康胶囊辅助治疗糖尿病合并肺结核疗效评价

自2004年7月至2006年7月对部分住院及门诊管理的117例糖尿病合并菌阳性初治肺结核患者在采用控制糖尿病饮食、口服降糖药物及标准抗结核化疗方案同时,用中药肺痨康胶囊进行治疗,观察痰菌阴转情况,结果如下.