快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究

目的 应用多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析（multiple—Polymerase Chain Reaction—Single Strand Conformation Polymorphism,multi—PCR—SSCP）方法,快速、特异地同时检出耐异烟肼（isoniazid,INH）结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况,并与直接测序（derictsequencing,DS）结果相比较,参照药敏试验,探讨该方法的可行性。 方法 根据结核分支杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用multi—PCR-SSCP技术,同时检测对结核分支杆菌耐INH起作用的这三个基因的突变情况;同时进行耐药株的测序分析。 结果 对H37Rv标准株、临床分离INH敏感株（23株）及INH耐药株（35株）进行multi—PCR—SSCP分析,突变检出率82．9％（29／35）;耐药株测序分析突变检出率为85．7（30／35）。两种方法的符合率为97．1％E（29＋5／）／35]。 结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索,multi—PCR—SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG三个INH耐药基因的突变,提高检验效率,有望成为临床指导用药的好方法。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫致男性不育的机制研究

目的调查了解男性泌尿生殖系阴道毛滴虫（Tv）感染情况与不育的关系,及发生机制的研究。方法涂片、瑞-姬（W—G）染色和培养用光学双目显微镜观察了1986例精液内Tv及精子的活率、活力等指标;采用肝-胨-糖培养方法,对Tv体外培养后,除去虫体,留取培养液,稀释成3个不同浓度,将10例正常生育男性的优化精子分为等体积的（A、B、C、D）4组：A组加入未培养Tv的原培养液,B、C、D组依次加入（1．2×10^8／L、6×10^8／L、1．2×10^9／L）梯度培养液,分别于37％水浴箱中孵育0．5、1、2、4h观察精子运动参数。结果Tv检出率为38％,Tv感染者精子运动参数明显低于正常生育者（P〈0．01）。Tv培养液浓度在6×10^8／L以上时,精子的活率和活力与对照组相比均显著降低（P〈0．05）,并呈浓度时间依赖性。结论Tv对精子运动能力有明显的损害作用及代谢产物是其主要的损害抑制因素,是造成不孕不育的重要原因之一。     

细胞学检查在结核性和恶性胸腹水鉴别诊断中的价值

本文通过探讨胸腹水细胞学在结核性和恶性胸腹水鉴别诊断中的价值.得出结论:胸腹水细胞学在结核性和恶性胸腹水的鉴别诊断中有较大的价值.     

5种血清miRNA的检测在前列腺癌诊断中的价值评估

目的 检测miR-141,miR-16,miR-103,miR-574,miR-34b等五种前列腺癌相关的miRNA在前列腺癌患者血清中的含量,评价其在前列腺癌诊断中的价值.方法 收集临床血清样本,将其分为前列腺癌、前列腺增生、PSA升高等三组,提取血清中miRNA.应用荧光定量PCR方法检测相应miRNA的含量,用GraphPad Prism软件进行统计学分析.结果 miRNA-103和miR-34b在前列腺癌患者、前列腺增生患者和PSA增高人群血清中的含量普遍较正常人增高,其中miRNA-34b平均增高2.2×104倍,在所有PSA升高的样本中均增高.其余3种miRNA的水平相对于正常人未呈现显著差异.结论 miR-34b的诊断价值与PSA相当,是一个潜在的前列腺癌诊断性血清标志物.     

肝素结合血凝素蛋白在结核病诊断中的应用研究

目的制备天然和重组肝素结合血凝素（HBHA）蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到大肠埃希菌BL-21中,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达HBHA蛋白,表达蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹法分析后,亲和层析法纯化蛋白,并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时将7H9液体培养基中的卡介苗（BCG）培养至稳定生长期,用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白。观察抗体对不同浓度天然HBHA和重组HBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果所得天然和重组HBHA蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。     

西安地区健康人群ALT与AST参考区间的初步探讨

目的 建立西安地区健康人群血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的参考区间.方法 参照IFCC多中心酶学研究参考人群筛选标准,募集18～79岁健康参考人群1 098人,其中男性506人和女性592人,分别用和光试剂检测系统、加入磷酸吡哆醛的罗氏试剂检测系统和不加磷酸吡哆醛的罗氏试剂检测系统建立西安地区健康人群酶活性参考区间.结果 三个系统间检测结果存在明显差异(P<0.01),各系统间男性和女性结果存在差异.ALT和AST需要按性别划分参考区间.不加磷酸吡哆醛的罗氏试剂检测系统ALT-1:7.46～51.34 U/L(女),9.09～71.06 U/L(男);AST-1:11.89～40.49 U/L(女),13.6～40.52 U/L(男).加入磷酸吡哆醛的罗氏试剂检测系统ALT-P:10.24～57.06 U/L(女),11.02～84.00 U/L(男);AST-P:13.55～50.14 U/L(女),15.3～53.42 U/L(男).和光试剂检测系统ALT:6.41～41.73 U/L(女),7.21～67.77 U/L(男);AST:9.41～40.64 U/L(女),12.1～41.11 U/L(男).结论 西安地区人群ALT和AST三个系统间检测结果的参考区间上限较目前临床所用参考区间较高,且各个检测系统间结果存在较大差异.罗氏加入磷酸吡哆醛试剂的参考范围高于不加磷酸吡哆醛试剂的参考范围,加入磷酸吡哆醛试剂的参考范围比不加磷酸吡哆醛试剂的参考范围高15%～20%.但不加磷酸吡哆醛试剂的参考范围高于和光试剂(不加磷酸吡哆醛)检测结果的参考范围,不加磷酸吡哆醛试剂的参考范围比和光试剂(不加磷酸吡哆醛)检测结果的参考范围约高10%.而和光试剂(不加磷酸吡哆醛)检测结果高于目前临床所用的参考范围.     

基于EVs的肿瘤诊断,距离真正的临床应用还有多远

作为一种新型的旁/自分泌及远程信号传导方式,细胞外囊泡(EVs)几乎参与了肿瘤发生、进展、转移、耐药等整个过程,对肿瘤诊疗产生了极大的启发。EVs具有作为血液或尿液生物标志物的强大潜力,可用于癌症的诊断、预后和监测。由于在临床上的巨大应用价值,近几年EVs成为肿瘤研究的热点。因此,本文讨论了EVs标志物在肿瘤临床诊断中的优势、进展方向和技术挑战。     

2种HBsAg定量检测系统对HBV不同感染阶段及不同基因型样本检测的一致性评价

目的分析罗氏MODULAR E170电化学发光免疫分析系统(简称罗氏E170)和雅培i2000化学发光微粒子免疫分析系统(简称雅培i2000)定量检测慢性乙型肝炎不同感染阶段、不同基因型患者的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)结果的一致性。方法收集临床未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清样本共125例,根据《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中的标准,将样本分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期4组,同时根据基因型(B/C)及HBs Ag水平(HBs Ag≤1 000 IU/m L/HBs Ag1 000 IU/m L)分组。用罗氏E170和雅培i2000 2种系统平行检测HBs Ag,分析各组间2种系统检测结果的一致性。结果 2种系统检测结果总体相关性、一致性好(r=0.989,P均0.001);在4个不同感染阶段,2种系统检测结果的相关性好(r值为0.977~0.993,P均0.001);在一致性分析中,免疫清除期、低复制期和再活动期样本检测结果的一致性较好,但在免疫耐受期罗氏E170检测结果较雅培i2000高,偏差为0.114 log IU/m L;B、C基因型组2种系统检测结果的相关性、一致性均好(r值均0.95,P均0.001);在HBs Ag高水平组中,2种系统检测结果的r值为0.959(P0.001),相关性较HBs Ag低水平组略差,但在专业可接受范围内;且在HBs Ag高水平组中,2种系统的偏差较大,罗氏E170检测结果比雅培i2000平均高0.076 log IU/m L。结论 2种系统检测不同感染阶段及不同基因型样本的相关性和一致性较好,但在检测免疫耐受期及高值样本时罗氏E170结果较雅培i2000偏高。临床上用HBs Ag预测抗病毒治疗的效果时,治疗前后应尽量选择同一系统的结果,以避免由于不同系统间的差异造成对治疗效果的错误评估。