炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物,扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子,从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定,生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物,可以扩增出长2 205 bp的保护性抗原基因,经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段,对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法 酵母经常规培养，抽提mRNA逆转录成cDNA后，经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段，根据目的基因SSAl设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记，与oligo阵列杂交，洗脱，扫描：然后进行杂交后剥除．收集剥除液．采用限制性通用引物扩增，产物克隆于PUC18T载体中，并转化至JM109大肠杆菌中培养，抽提质粒，进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明，用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因，而无需构建cDNA文库。另外，本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

靶向COL1A1基因的 shRNA对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响

 目的：探讨抑制Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）基因表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响。方法：用已构建的pSilencer2.1-U6-COL1A1重组质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用RT-PCR和Western blotting技术检测重组质粒对COL1A1基因表达的影响,MTT比色法测定细胞增殖的抑制情况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化。结果：RT-PCR及Western blotting结果证实重组质粒在mRNA和蛋白水平分别显著抑制COL1A1基因表达;pshRNA-COL1A1转染组细胞的增殖速度明显减慢且呈时间依赖关系;与对照组相比,pshRNA-COL1A1组细胞明显阻滞于G₀/G₁期,细胞凋亡率显著升高（P<0.05）,出现细胞质浓缩、核凝聚等凋亡形态学变化。结论：pshRNA-COL1A1能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,为以COL1A1为靶点的乳腺癌基因治疗提供实验依据。     

MiR-138对MCF-7细胞端粒酶活性及端粒稳定性的调控作用

 目的 研究MiR-138通过HTERT作为下游靶基因,对人乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性的调控作用及端粒稳定性的影响。方法 在人乳腺癌MCF-7细胞中瞬时转染MiR-138 模拟物,用MTT法检测细胞增殖活性,并于转染后48h,用实时定量RT-PCR检测端粒酶催化亚单位HTERT表达、TRAP Assay检测端粒酶活性,同时对细胞进行53BP1 抗体免疫荧光染色及端粒的FISH染色。结果 转染后48h,MiR-138模拟物处理的MCF-7细胞HTERT表达水平比对照细胞降低2.18倍(2-△△Ct),端粒酶活性比对照细胞降低2.69倍,53BP1聚集形成的凝集点（Foci）,部分与端粒位点重合,比率达到20.62%±1.55% 。结论 MiR-138以HTERT作为下游靶分子,调控MCF-7细胞端粒酶活性,影响细胞端粒稳定性。     

bcr-abl基因沉默对相关基因表达的影响

目的运用RNAi技术,研究使bcr-abl基因沉默后相关基因表达变化。方法针对bcr-abl基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行细胞计数及流式细胞仪检测,观察干扰效果,应用RT-PCR检测相关基因表达变化。结果转染组与对照组相比,细胞数减少,有明显的细胞凋亡,bcr-abl,N-ras,c-myc基因的mRNA表达量降低。结论运用RNAi技术,可以有效地诱导细胞凋亡,抑制相关基因的表达,为研究CML的发生机制奠定基础。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

SARS冠状病毒N基因的扩增与克隆

目的RT-PCR扩增、克隆SARS冠状病毒N蛋白基因。方法根据GenBank数据库中TOR2株的全基因组序列,利用Primer Premier 5.0软件设计引物RT-PCR巢式扩增SARS冠状病毒的N基因,PCR产物克隆后进行测序鉴定。结果序列分析表明,pMD18-T载体中已成功重组了N基因。结论N蛋白基因的扩增、克隆成功,为N蛋白的表达、N蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

DNA芯片技术筛选K562肿瘤细胞特异性基因

目的应用DNA芯片技术筛选人白血病K562细胞中的肿瘤特异性基因。方法提取正常人白细胞和K562细胞基因组DNA,并用限制性内切酶Sau3AI酶切。其中K562细胞基因组酶切产物经DNA聚合酶Ⅰ补平加A后克隆到T-载体,挑选阳性克隆,用PCR扩增,以纯化的PCR产物做探针,制备K562细胞基因组DNA芯片。正常人白细胞基因组酶切产物加上人工通用接头,用限制性标记技术标记上荧光标记物Cy3,与制备的K562细胞基因组DNA芯片杂交。结果芯片杂交结果经扫描分析,发现42个K562细胞肿瘤特异性基因,进一步用序列分析证实,其中有1个为BCR(breakpoint cluster gene)基因。结论我们自制的K562细胞基因组DNA芯片可以成功地用于筛选肿瘤特异性基因,为更好地从基因组水平研究肿瘤发生的分子机制提供了新的技术途径。     

应用70 mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法酵母经常规培养,抽提mRNA逆转录成cDNA后,经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段,根据目的基因SSA1设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记,与oligo阵列杂交,洗脱,扫描。然后进行杂交后剥除,收集剥除液,采用限制性通用引物扩增,产物克隆于PUC18T载体中,并转化至JM109大肠杆菌中培养,抽提质粒,进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明,用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因,而无需构建cDNA文库。另外,本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。