基于生物信息学的hsa-miR-32靶基因预测与功能分析

目的 利用生物信息学方法,预测hsa-miR-32的靶基因并分析其功能,为深入研究其生物学功能提供指导和思路。方法 利用miRBase数据库获取并分析不同物种的miR-32序列特征;从公共GEO（gene expression omnibus,GEO）数据库中下载不同疾病相关的microRNA表达谱芯片数据,通过miRGator v3.0在线工具和Qlucore Omics Explorer 3.0软件分析hsa-miR-32在不同疾病组织中表达情况;并用PicTar、DIANA-microT-CDS 7.0、PITA及miRanda等方法预测hsa-miR-32靶基因,对获得的靶基因集合分别进行功能富集分析（gene ontology analysis）和生物通路富集分析（pathway enrichment analysis）。结果 miR-32在不同物种间高度保守。与癌旁正常组织相比,hsa-miR-32在子宫癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌组织中表达异常（均有P<0.05）。包括已被证实的靶基因,共得到168个候选基因,这些靶基因主要参与调控基因表达、细胞增殖、信号转导、细胞死亡等生物学过程（均有P<0.05）,涉及小细胞肺癌、前列腺癌、胶质瘤、黑素瘤等疾病相关通路,以及p53等肿瘤相关信号通路和细胞周期等信号转导通路（均有P<0.05）。结论 hsa-miR-32功能广泛,与癌症的发生、发展密切相关。     

RNA干扰技术的实现与研究进展

RNA干扰(RNA interference of RNAi)是继PCR技术之后又一划时代的基因工程研究方法。本文综述了RNAi的发现、作用机制、实现技术过程、转染方法和国内外的研究现状和发展趋势。RNAi技术的迅速成熟为基因治疗提供了有力的技术支持。1 RNAi的发现和作用机制人们一直认为是DNA转录成mRNA,mRNA翻译成蛋白质,但是RNAi的发现使人们认识到事实是非常复杂的。     

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。     

限制性显示技术在制备丙型肝炎病毒分型芯片探针的应用性研究

目的：探讨限制性显示(restrictuion display,RD)技术在制备丙型肝炎病毒(HCV)分型芯片探针的可行性。方法:用限制性内切酶Sau3A I消化HCV1a、1b、2a亚型全长cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物进行分组PCR,使得各片段得以扩增并分布于10个亚组中,经聚丙烯酰胺电泳(PAGE)结合银染法进行分离。切胶回收后作3次PCR,得到较纯净的HCV cDNA限制性片段。对这些片段做分子克隆,并测序鉴定。结果:由HCV 3个亚型1a、2a、1b的全长cDNA得到66个大小相对均一(200～900bp)的限制性片段,平均每个亚型约22个。测序结果表明,属于HCV基因,可以作为HCV分型芯片的探针。结论:RD技术能快速收集大量长度适宜、大小均一的病毒基因片段,适合于分型诊断基因芯片探针的收集。     

Let-7a在人宫颈癌HeLa细胞不同周期时相的表达

目的 探讨微小RNA let-7a在HeLa细胞不同周期时相的差异表达.方法 应用经典的双胸苷阻断法将HeLa细胞同步化于不同的周期时相,应用流式细胞术检测同步化的效率.应用实时荧光定量RT-PCR方法 检测不同周期时相的HeLa细胞中let-7a的表达水平.结果 HeLa细胞G1、S和G2/M期细胞同步化效率分别约为84.81%、83.65%和77.69%;let-7a在不同周期时相均有表达且存在差异,G1和S期表达水平较低,G2/M期表达水平较高.结论 细胞周期对let-7a的表达有较大的影响,这为理解细胞周期调控的具体机制提供了新的线索.     

EBV全基因组芯片的制备及应用

目的 鼻咽癌高发于中国南方,是一种恶性度较高的肿瘤,与EB病毒(EBV)关系非常密切.本研究利用前期已经设计和克隆好的EBV已知和预测的编码基因作为eDNA探针,构建EBV芯片,用于检测鼻咽癌组织中的EBV基因表达.方法 85个EBV基因探针通过一对设计于T/A克隆载体多克隆两端的引物进行PCR扩增.产物纯化后,与8000个人基因打印到同一张玻片上,建立EBV与人基因的检测芯片.随后用于检测鼻咽癌组织与正常鼻咽组织之间的基因表达差异,观测检测效果,以确定是否可以临床应用.结果 在人的基因表达谱中,我们成功检测了大量的人基因表达.而在EBV阵列中,我们虽然得到了一些EBV基因表达的信号,但这些信号都非常微弱,没有明显可见的荧光,其表达强度无法与人的基因表达信号强度相比.结论 虽然我们成功地构建了EBV芯片,但由于可能受到基因芯片检测的敏感性以及EBV基因在鼻咽癌中表达量的限制,不能用于临床检测,需要进一步改进研究方法.     

HSV-2的生物信息学分析及其Oligo探针设计

目的设计单纯疱疹病毒2型（HSV-2）诊断芯片的Oligo探针。方法利用BLAST软件对HSV-2的DNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;用生物学软件Olig06．0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针。结果获得13条60-mer Oligo探针。结论利用BLAST系统和生物学软件Olig06.0设计HSV-2诊断芯片的探针,可为后期打印成DNA芯片,用于HSV-2的检测打下基础。     

人巨细胞病毒诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡

目的 探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染ECV304血管内皮样细胞的致病机制。方法 常规方法传代细胞和接种病毒。以PCR法和间接免疫荧光法检测病毒即刻早期基因（IE gene）及其蛋白表达;相差显微镜及电子显微镜观察病毒感染后细胞和细胞器形态变化;DNA梯度法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果 病毒感染后72h开始出现胞体变圆、缩小、脱壁,胞质内颗粒增多,细胞边缘模糊不清的特征,可明显检测出病毒特异IEgene及其蛋白表达;电镜结果显示病毒感染96h后,胞质内明显空泡化,细胞膜微绒毛减少,核染色质浓集、边缘化,线粒体出现溶酶体化、空泡化和自噬现象,呈早期凋亡特征;DNA梯度电泳结果显示感染细胞DNA片段化特征的条带：流式细胞仪检测发现感染4d和6d时,细胞调亡率分别为4．1％和45．7％。结论 巨细胞病毒在体外细胞培养中可诱导ECV304血管内皮样细胞的凋亡。     

基于PCR的siRNA表达框的制备

目的 改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用。方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板。选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH—SY5Y细胞48h后提取RNA进行RT—PCR,检测RNA干扰的效应。结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确。细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制。结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究。     

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1( )/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1( )中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1( )/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。