乳腺癌转移相关通路的基因集富集分析

目的探讨与乳腺癌转移相关的生物信号通路及因素。方法以乳腺癌转移相关的3组基因芯片表达谱数据为研究材料,登录号分别为GSE2034、GSE2603以及GSE12276。将乳腺癌样本分为原发癌和转移癌两组,原始数据经RMAExpress软件进行质量检验和标准化,采用GSEA通路富集工具对乳腺癌转移相关通路进行分析。结果有20条生物信号通路与乳腺癌的转移有着密切关系,其中基因集上调的有17个,下调的有3个,主要涉及细胞周期与增殖、代谢途径、血管生成、迁移、免疫系统等信号通路。结论乳腺癌转移除与肿瘤细胞的活力和增殖能力提高有关外,还与肿瘤细胞的迁移和运动能力进一步增强及机体免疫系统损害有关。     

基因芯片技术检测丁型肝炎病毒的研究

目的制备检测丁型肝炎病毒(HDV) 基因芯片。方法针对HDV基因保守区域设计多对PCR引物。用芯片点样仪将PCR产物点到玻片上制成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术,样品标记后进行杂交。结果运用PCR技术得到多个HDV特异性基因片段,序列分析表明,所扩增的片段均属于HDV特异基因。杂交结果显示,样品和HDV诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳。结论用基因芯片检测HDV具有敏感、高效、检测结果可靠的优点,有着较大的应用前景。     

利用绿色荧光蛋白筛选酵母突变株的新方法

目的建立快速简便筛选酵母突变株的方法。方法利用同源重组技术,通过转座子上的GFP基因,从酵母基因组文库中,检测发生突变的菌株,从而筛选出酵母突变株。结果应用荧光显微镜观察SC-ura 选择平板筛选出的酵母,有绿色荧光发出的即为阳性菌落。结论利用同源重组技术,初步筛选出了所需的酵母突变株。     

精子基因表达谱研究初探

目的应用限制性显示技术,收集正常成年男性的精子基因表达谱探针,制备相应的精子表达谱芯片,以对成年男性正常精子的基因表达情况有一全面、系统的了解。方法提取成年男性正常精子的总RNA,逆转录为cDNA,经限制性内切酶酶切、加接头、PCR扩增、转化、克隆、鉴定等操作,收集成年男性正常精子的基因表达谱探针,制备相应的精子表达谱芯片,并进行初步的杂交分析。结果收集了1 859个基因片段,取其中368个基因探针制备芯片,进行了小量初试。结论证实在精子中有大量基因表达;提示我们自行制备的精子基因表达谱探针也具有较好的特异性和可信性。     

细胞周期蛋白依赖性激酶-2两种剪接体在SH-SY5Y细胞中共表达

目的观察细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK-2)在SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法采用RT-PCR方法研究CDK-2的表达,用DNA银染技术观察PCR产物,割胶回收后,克隆到载体上、测序。结果在聚丙烯酰胺胶上可以观察到两条DNA带,相对分子质量小的DNA带染色较弱;将两条DNA带切下,回收后与载体连接,测序证实两条DNA带均为CDK-2基因的产物。结论CDK-2的两种剪接形式在SH-SY5Y细胞中共表达,其中一种剪接形式是第五外显子缺如,但其表达量比较弱,其作用机制仍有待于进一步研究。     

hsa-miR-30e的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆hsa-miR-30e并构建其慢病毒表达载体.方法 PCR扩增hsa-miR-30e的前体序列,克隆于慢病毒载体pll3-7,转染包装细胞293FT细胞.收获病毒颗粒,荧光定量PCR检测hsa-miR-30e的表达.结果 经双酶切及测序鉴定,hsa-miR-30e的慢病毒表达载体构建成功,倒置荧光显微镜下观察转染后293FT细胞发出绿色荧光.结论 成功构建hsa-miR-30e的慢病毒表达载体,为进一步研究hsa-miR-30e的生物学功能奠定了基础.     

基于生物信息学的hsa-miR-32靶基因预测与功能分析

目的 利用生物信息学方法,预测hsa-miR-32的靶基因并分析其功能,为深入研究其生物学功能提供指导和思路。方法 利用miRBase数据库获取并分析不同物种的miR-32序列特征;从公共GEO（gene expression omnibus,GEO）数据库中下载不同疾病相关的microRNA表达谱芯片数据,通过miRGator v3.0在线工具和Qlucore Omics Explorer 3.0软件分析hsa-miR-32在不同疾病组织中表达情况;并用PicTar、DIANA-microT-CDS 7.0、PITA及miRanda等方法预测hsa-miR-32靶基因,对获得的靶基因集合分别进行功能富集分析（gene ontology analysis）和生物通路富集分析（pathway enrichment analysis）。结果 miR-32在不同物种间高度保守。与癌旁正常组织相比,hsa-miR-32在子宫癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌组织中表达异常（均有P<0.05）。包括已被证实的靶基因,共得到168个候选基因,这些靶基因主要参与调控基因表达、细胞增殖、信号转导、细胞死亡等生物学过程（均有P<0.05）,涉及小细胞肺癌、前列腺癌、胶质瘤、黑素瘤等疾病相关通路,以及p53等肿瘤相关信号通路和细胞周期等信号转导通路（均有P<0.05）。结论 hsa-miR-32功能广泛,与癌症的发生、发展密切相关。     

RNA干扰技术的实现与研究进展

RNA干扰(RNA interference of RNAi)是继PCR技术之后又一划时代的基因工程研究方法。本文综述了RNAi的发现、作用机制、实现技术过程、转染方法和国内外的研究现状和发展趋势。RNAi技术的迅速成熟为基因治疗提供了有力的技术支持。1 RNAi的发现和作用机制人们一直认为是DNA转录成mRNA,mRNA翻译成蛋白质,但是RNAi的发现使人们认识到事实是非常复杂的。     

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。     

限制性显示技术在制备丙型肝炎病毒分型芯片探针的应用性研究

目的：探讨限制性显示(restrictuion display,RD)技术在制备丙型肝炎病毒(HCV)分型芯片探针的可行性。方法:用限制性内切酶Sau3A I消化HCV1a、1b、2a亚型全长cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物进行分组PCR,使得各片段得以扩增并分布于10个亚组中,经聚丙烯酰胺电泳(PAGE)结合银染法进行分离。切胶回收后作3次PCR,得到较纯净的HCV cDNA限制性片段。对这些片段做分子克隆,并测序鉴定。结果:由HCV 3个亚型1a、2a、1b的全长cDNA得到66个大小相对均一(200～900bp)的限制性片段,平均每个亚型约22个。测序结果表明,属于HCV基因,可以作为HCV分型芯片的探针。结论:RD技术能快速收集大量长度适宜、大小均一的病毒基因片段,适合于分型诊断基因芯片探针的收集。