乙型肝炎病毒基因组剪接变异体结构分析

目的 了解乙型肝炎病毒(HtBV)基因组剪接变异体的基因结构及特点。方法 从慢性乙型肝炎患者血清中扩增并克隆HBV基因组剪接变异体DNA，测序并比较基因结构特点。结果 共获得10种HBH基因组剪接变异体，基因组大小介于765～2039bp之间。导致剪接变异体产生的5′端供体位点和3′端受体位点各6个。HBVH基因组剪接变异体在C、前-Sl、前-S2及S编码区存在不同程度的缺失，但均保留与致病密切相关的X基因以及病毒复制、包装所必须的DNA序列。结论 HBV基因组剪接变异体在慢性乙型肝炎患者血清中普遍存在。     

乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白致HepG2细胞凋亡的蛋白质组学分析

目的 研究乙型肝炎病毒(hepatitits B virus,HBV)表面抗原大蛋白(large envelope protein,LHB)对HepG2细胞凋亡的影响,并以蛋白质组学方法探讨其机制.方法 以腺病毒表达载体pShuttle-IRES-hrGFP-1克隆HBV LHB基因,经重组、包装后获得重组腺病毒Ad-LHB,与空载体重组腺病毒Ad-GFP分别感染HepG2细胞,采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、JC-1细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒和碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡情况.Ad-LHB及Ad-GFP分别感染HepG2细胞,提取细胞总蛋白,各取600μg蛋白样品进行双相电泳,R350染色,以双相电泳图像分析软件ImageMaster 2D Platinum确定差异蛋白点,Ettan斑点自动挖胶系统切取差异蛋白,脱色酶解后进行MALDI-TOF-TOF MS鉴定并分析.结果 Ad-LHB感染导致HepG2细胞凋亡明显增加.双向电泳及扫描分析显示Ad-LHB与Ad-GFP感染的HepG2细胞共有39个蛋白差异.质谱分析并确定其中的33种共36个蛋白,这些差异蛋白质有9种与细胞凋亡密切相关,其中,CAPN2、eIF3K和PPP2CB在Ad-LHB感染HepG2细胞表达增高,SERPINH1、LASP1、PRDX1、DHRS2、LDHA和PSMA4在Ad-LHB感染HepG2细胞表达降低.结论 HBV LHB可致HepG2细胞凋亡,多种细胞凋亡相关蛋白参与此过程.     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞侵袭的影响

目的 研究HBV全长对HepG2细胞侵袭相关基因表达及活性的影响,探讨HBV在整体水平对HepG2细胞侵袭的影响.方法 采用定量PCR分析HBV对HepG2细胞MMP2、9和TIMP1-4基因转录的影响;通过明胶酶谱及反相明胶酶谱检测MMP2、MMP9及TIMPs的活性;应用体外侵袭小室法检测细胞的侵袭能力.结果 HBV的复制可以促进HepG2细胞MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP3基因的转录,抑制TIMP4基因转录,增强HepG2细胞MMP2 、MMP9的活性并增强细胞中TIMP1、TIMP3功能,HBV稳定复制的细胞具有更强的体外侵袭能力.结论 HBV可影响HepG2细胞MMPs和TIMPs的基因转录、表达及功能,促进HepG2细胞的体外侵袭,这可能与HBV相关的HCC侵袭转移密切相关.     

补充验证试验在抗-HCV检测中的应用

目的探讨补充验证试验在一般人群抗-HCV检测中的应用.方法应用重组免疫印迹实验(RIBA)对血清抗-HCV酶联检测结果阳性者进行抗-HCV确认,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV RNA.结果2002～2003年福州市部分人群血清抗-HCV酶联检测的阳性率为0.593%,低于贵州出入境人群和部分地区无偿献血员的抗-HCV检出率,而与长沙和南京地区无偿献血员的检出率相近.抗-HCV酶联检测阳性者经RIBA确认后,仅1例阳性,6例为阴性,另有5例结果为不确定.5例不确定者的血清经RT-PCR检测HCV RNA,结果均为阴性.结论RIBA和RT-PCR作为抗-HCV酶联检测的补充试验有助于抗-HCV检测结果的确认和解释,可在抗-HCV检测中推广应用.     

C2-神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡

目的 观察无血清条件下神经酰胺对人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用。方法 采用AO-EB荧光染色、流式细胞术DNA倍体分析和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果 终浓度10μmol/L的C2-神经酰胺作用24h，可诱导无血清培养的SMMC-7721细胞发生凋亡，AO-EB染色可见典型的细胞凋亡表现，细胞核固缩、浓染、裂解，细胞质芽突脱落成为凋亡小体。经流式细胞仪检测可见典型的亚二倍体峰。DNA凝胶电泳呈现典型的180-200bp的DNA梯状条带。结论 C2-神经酰胺可诱导SMMC-7721细胞凋亡。     

弓形虫主要表面抗原P30的克隆、表达与纯化

目的通过分子克隆技术获取弓形虫主要表面抗原P30蛋白。方法自行设计引物,通过PCR扩增获得P30基因片段,采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,定向克隆到载体pThioHis中,转化大肠杆菌Top10,利用酶切、DNA序列分析鉴定阳性克隆,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,融合蛋白通过镍结合树脂(ProBond~(TM)Resin)进行纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)鉴定。结果PCR、酶切、连接的产物经电泳鉴定,均与预期设计相符合。DNA序列分析结果表明,除一个同义突变,其余均与文献报道相符。IPTG诱导表达后经层析纯化获得46kDa含P30的融合蛋白。结论通过定向克隆、表达与纯化,获得含P30的融合蛋白。     

弓形虫P24基因细胞内定位载体重组质粒的构建

目的 构建编码弓形虫RH株P24基因的细胞内定位载体并进行其序列测定。方法 弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，Trizol试剂盒抽提基因组RNA；根据基因库P24基因序列设计合成引物，采用RT—PCR法扩增编码P24的基因片段，经低熔点琼脂糖法回收并纯化；将P24基因定向克隆到细胞内定位载体pCMV／myc系列：pCMV／myc／cyto(胞质定位)、pCMV／myc／nuc(核定位)、pCMV／myc／mito(线粒体定位)及pCMV／myc／ER(内质网定位)。转化大肠杆菌TOPl0感受态细胞，在氨苄青霉素阳性LB培养基平板上筛选出阳性克隆。重组子经双酶切，PCR鉴定，最后对重组子进行序列测定。结果 RT—PCR方法从弓形虫RH株扩增572bp的P24基因片段，分别构建重组质粒pCMV／myc／cyto—P24、pCMV／myc／nuc—P24、pCMV／myc／mito—P24和pCMV／myc／ER-P24，酶切和PCR鉴定产物大小与预期值相符合，序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P24抗原的基因片段。结论 成功构建编码弓形虫表面抗原P24基因真核细胞内定位载体重组质粒pCMV／myc／cyto—P24、pCMV／myc／nuc—P24、pCMV／myc／mito-P24和pCMV／myc／ER—P24。     

HBx基因转染对Huh7细胞中基因转录的影响

目的：研究且酞基因对肝癌细胞Huh7中基因表达的影响，为探讨且戳在肝癌发生发展中的分子机制提供依据。方法：以pcDNA3．1b质粒为载体，将HBx转入Huh7细胞中，同时将pcDNA3．1b作空白对照。用Western印迹法证实基因转染成功。应用Affymetrix公司的人类全基因组寡核苷酸基因芯片分析转染HBx基因前后，Huh7细胞的基因表达谱。随机选择转染前后有明显差异的6个基因（3个上调，3个下调），用荧光定量PCR技术进行验证。结果：从基因芯片结果分析中发现，与对照组相比,HBx转染后Huh7细胞中明显上调的基因有88个，下调的基因有111个，这些差异基因的功能涉及多个方面。结论：HBx基因对肝癌细胞的影响是双向的，既有转录激活的作用，同时又有转录抑制的功能。这些数据对于理解HBx基因在肝癌发生发展中的作用具有重要的参考意义。     

低表达bcl-2对神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的观察无血清条件下bcl-2对神经酰胺诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法通过脂质体介导的基因转染，建立稳定转染表达反义bcl-2 mRNA的cDNA片段的真核表达质粒的人肝癌细胞HepG2（HepG2—anti-bcl-2）并鉴定，采用AO-EB荧光染色、流式细胞术DNA倍体分析和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡，分光光度法测定Caspase-3活性。结果终浓度50μmol／L C2-神经酰胺作用24h，可诱导无血清培养的HepG2细胞、HepG2-vector细胞及HepG2-anti—bcl-2细胞发生凋亡。AO-EB染色可见典型的细胞凋亡表现。流式细胞仪检测显示C2-神经酰胺作用12，18，24h，HepG2—anti—bcl-2细胞凋亡率较同时间HepG2细胞及HepG2—vector细胞凋亡率显著增加（P〈0．05）。终浓度50μmol／L C2-神经酰胺作用12h，HepG2—anti—bcl-2细胞DNA凝胶电泳呈现梯状条带，而HepG2细胞及HepG2—vector细胞作用24h出现DNA梯状条带。HepG2细胞和HepG2-vector细胞Caspase-3活性随C2-神经酰胺（50μmol／L）作用时间延长而增强，HepG2-anti—bcl-2细胞Caspase-3活性始终维持较高水平。结论低表达bcl-2可通过增加Caspase-3活性从而促进C2-神经酰胺诱导的HepG2细胞凋亡。     

鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒的构建和鉴定

目的 构建含鼠连接蛋白43基因的真核表达重组质粒。方法 从胎鼠中提取总RNA，经RT-PCR方法获得并扩增含全部编码序列的连接蛋白43cDNA片段，将其克隆到pBudCE4．1真核表达载体上，并进行酶切鉴定和测序分析。结果 RT-PCR技术扩增出约1．1kb的连接蛋白43基因全部编码序列的片段。测序分析证实所插入连接蛋白43基因片段的序列完全正确。结论 鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒成功构建。