完整细胞斑点印迹技术在检测HXO—Rb44细胞基因表达中的应用

细胞的基因表达的检测在医学研究和临床上皆有广泛的应用。有报道应用碱变性ＤＮＡ,同时也裂解了胞膜,再进行完整细胞ＤＮＡ原位斑点印迹检测[1]。虽在1986年Ｙｕ[2]曾报道过原核细胞胞浆液的ＲＮＡ原位斑点印迹,但这首先需制备细胞浆液,而我们是直接将完整真核细胞悬液点在ＮＣＭ上,便于检测斑点印迹信号相对强度,也可同时点在玻片上,进行原位杂交或免疫组化的定位观察。1　材料与方法1.1　ＤＩＦ装置　自制,在直径为0.8ｃｍ×4ｃｍ长度的塑料小管底部有一小洞,每管80%的容积充填优质吸水材料,表层覆以两层吸水绵纸以承受直径为0.7ｃｍ圆形…     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置（ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ）提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止ＲＮａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

8-Br-cAMP与顺铂对Eca-109细胞DNA polβ,wtp53基因表达及多药耐受蛋白的影响

目的比较分化诱导剂8-Br-cAMP与基因毒性药物顺铂对Eca-109细胞DNA polβ及wtp53基因表达和多药耐受蛋白的影响.方法分别制备生物素和地高辛标记的polβ探针和生物素标记的野生型p53(wtp53) 探针,并检测各探针灵敏度.将培养的人食管癌Eca-109细胞分组如下①8-Br-cAMP组(Br组);②不加8-Br-cAMP的对照组(C1组),①②组同时培养48 h; ③顺铂组(Pt组);④不加Pt的对照组(C2组),③④组同时培养24 h.应用原位杂交技术显示各组细胞polβ基因的表达.对①②及③组细胞进行polβ及wtp53双信号原位杂交,并应用多药耐受蛋白(MRP)的免疫组化方法检测耐药性.结果生物素标记的polβ探针的杂交信号呈兰紫色细颗粒,分布于胞质; Br组信号弱于C1组, P<0.05.Pt组的信号比C2组强,P<0.05.Br组的MRP-IR弱于C1组,P<0.05; Pt组的多药耐受蛋白免疫反应性(MRP-IR)强于C2组,P<0.05.地高辛标记的polβ探针的杂交信号呈橙色细颗粒,生物素标记的wtp53探针的杂交信号呈蓝紫色细颗粒,均分布于胞质.在双杂交信号细胞内C1组的橙色强于蓝紫色信号;而Br组的蓝紫色信号较明显,Pt组的橙色信号较C1组更显著,3组相比P皆<0.05.结论8-Br-cAMP可下调polβ基因表达及耐药性,上调wtp53基因表达,提示Eca-109细胞polβ基因是高表达的,8-Br-cAMP具有使细胞趋向正常分化效应;相反,顺铂上调polβ基因表达及耐药性,下调wtp53基因表达,提示Pt可能导致增变基因表型增加,分化诱导剂比基因毒性药物治疗肿瘤可能具有较好的疗效.     

人食管癌组织DNA聚合酶β基因表达水平及定位

目的 :探讨人食管癌组织中DNA聚合酶 β基因 (polβ)表达水平及定位。 方法 :取 17例食管癌患者的癌组织、癌旁组织及其距癌灶 4～ 5cm处的正常组织。每块组织分 2等份 ,其中 1份常规石蜡包埋切片进行原位杂交 ,另 1份提取总RNA进行RNA斑点印迹 ,并以TLC扫描数值。结果 :蓝紫色杂交信号颗粒定位于胞质。弱信号见于正常组织的上皮基底细胞 ;癌旁组织的增殖细胞信号增强 ;癌组织分化较高的癌巢信号较弱 ;浸润的癌细胞信号强。原位杂交信号积分值与TLC扫描数值在癌、癌旁及正常组织中依次降低 (P <0 .0 5或P <0 .0 0 1)分别为 :癌组织 (32 .1± 7.8)和 (35 .8± 8.7) ,癌旁组织 (2 2 .1± 5 .3)和 (2 8.1± 6 .8) ,正常组织 (11.2± 2 .4 )和 (11.2± 2 .7)。结论 :人食管癌组织polβ基因呈高表达 ,DNA聚合酶 β较高表达可能是癌变早期事件。     

食管癌高发区人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的：研究林州市食管癌高发区病例的食管癌组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况。方法：利用PT-PCR、SSCP和序列分析对食管癌高发区50例食管癌及癌旁组织标本中polβ基因进行检测。结果：50例食管癌标本中有22例polβ发生变异,突变率为44％(22／50);而癌旁组织仅2例异常,突变率为4％(2／50)。突变形式有：58bp(177位到234位)的基因片段缺失;375位A→G(Ⅱe→Val),454位T→C(Phe→Ser),462位G→T(Glu→终止码),466位G→A(Gly→Glu),613位A→T(Lys→Ⅱe),648位G→C(Gly→Arg),660位A→G(Arg→Gly)。结论：食管癌高发区食管癌组织存在polβ基因突变,且突变率较高;该酶基因突变可能与食管癌的发生、发展相关。     

淋巴细胞转化与酸性酯酶活性相关性研究

对20例健康成人微量周血(0.1ml)标本同时进行PHA刺激淋巴细胞转化试验和酸性非特异性酯酶(ANAE)分型的细胞化学染色。结果显示淋巴细胞转化率与ANAE点型细胞百分率之间呈显著正相关。17%的转化T淋巴母细胞ANAE阳性反应呈局灶性点样型,而83%的转化T淋巴母细胞ANAE阳性反应显著增强,呈弥散样型。提示ANAE总阳性反应是T淋巴母细胞的可靠标志。