食管鳞癌的肿瘤干细胞标志

目的:探讨食管鳞癌组织和其细胞系的肿瘤干细胞(CSC)标志.方法:应用免疫酶或免疫荧光技术检测20例食管鳞癌组织和细胞(Eca-109和EC9706)中CD133、CD44以及多药耐药基因1(MDR1)的表达和定位.结果:食管鳞癌细胞中CD133和MDR1一致强阳性的细胞占30%-43%,CD133和CD44一致强阳性的细胞约占40%.CD133强阳性小细胞占癌细胞的8%,癌组织中约为4%.CD133强阳性小细胞位于鳞癌上皮的基底层、癌珠周缘或癌灶内;CD44强阳性细胞约占40%,其中包含2个亚群:少数较小CD44阳性的细胞亚群定位于鳞癌上皮的基底层、癌珠周缘或癌灶内;较大CD44强阳性细胞的亚群主要定位于鳞癌上皮棘细胞层及癌灶中.结论:CD133强阳性小细胞和CD44强阳性细胞可能是CSC的标志.     

槲皮素对过氧化氢损伤小鼠成纤维细胞的保护作用

目的探讨槲皮素对过氧化氢(H_2O_2)损伤小鼠成纤维细胞(NIH-3T3)的保护作用。方法体外培养NIH-3T3细胞,取对数生长期的NIH-3T3细胞分成四个实验组。对照组(C)仅加含有10%胎牛血清的DMEM培养基。实验1(Q_1)组先用0．5mmol/LH_2O_2作用细胞30min,然后再用含有50μmol/L的槲皮素培养基作用24h。实验2(Q_2)组先用含有501μmol/L的槲皮素培养基作用24h,再换含有0．5mmol/L H_2O_2作用细胞30min。H_2O_2实验(H_2)组先用含有0．5mmol/L H_2O_2作用细胞30min,再换仅含有10%胎牛血清的DMEM培养基作用24h。取培养细胞提取DNA和制备1×10~7/ml细胞悬液的滴片,应用TUNEL和Ladder电泳检测细胞凋亡率；应用Weaster blod和细胞免疫组化技术检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、HSP-70、NF- kB蛋白质的表达。结果由TUNEL和Ladder实验得出,Q_1组的细胞凋亡率明显低于H_2组和Q_2组。由Weaster blod和细胞免疫组化技术检测分析得出,Q_1组与Q_2、H_2组相比,Bcl-2的表达明显增高,Bax、Caspase-3、NF-kB、HSP-70的表达减低。结论槲皮素可能主要是通过抑制NF-kB的表达,提高HSP-70的表达,对H_2O_2诱导的NIH-3T3细胞损伤产生保护作用。     

槲皮素对NIH-3T3细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨槲皮素对NIH-3T3细胞氧化损伤的保护作用。方法取处于对数生长期的3T3细胞,平均分为以下四个实验组。槲皮素前保护组(Q1组):先加含有50μmol/L槲皮素培养液培养24h,再换含有0.5mmol/LH2O2的培养液培养30min。槲皮素后保护组(Q2组):先加含有0.5mmol/LH2O2的培养液培养30min;再换含有50μmol/L槲皮素培养液培养24h;H2O2损伤组(H2组):先加含有0.5mmol/LH2O2的培养液培养30min,再换仅含有10%的胎牛血清的培养液培养24h。对照组(C组):仅加10%胎牛血清的DMEM培养液培养24h。收集并裂解各组细胞,检测细胞内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH、NOS、NO、MDA的变化,应用MTT实验检测3T3细胞的生存率。结果Q1与Q2、H2组相比,Q1组细胞内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH均有增加,NOS、NO无明显改变,MDA减少,细胞存活率明显增加。结论槲皮素可能是通过上调抗氧化酶系活性对3T3细胞的氧化损伤产生保护作用。     

板层状鱼鳞病患者指甲和鳞屑内皮蛋白及鳞屑类脂的变化

目的:探讨板层状鱼鳞病(RLI)患者的指甲和鳞屑内皮蛋白和鳞屑类脂的表型改变情况.方法:取5例RLI患者和10 例正常人修剪的指甲和表皮鳞屑,行指甲内皮蛋白的免疫印迹、指甲和鳞屑内皮蛋白的免疫组化染色和鳞屑类脂的组织化学染色,利用在图像分析仪对所染色图像进行分析.结果:指甲总蛋白电泳图显示正常人呈现4条主带,RLI呈现5条主带(69 000、63 000、54 000、48 000、38 000);免疫印迹显示指甲内皮蛋白表达的相对分子质量主要位于63 000～158 000范围,其中RLI患者指甲内皮蛋白69 000呈过高表达.免疫组化显示RLI患者指甲和鳞屑内皮蛋白表达下调,组织化学染色显示鳞屑类脂中鳞脂、胆固醇和不饱和脂肪酸含量均降低.结论:RLI患者指甲和鳞屑内皮蛋白和鳞屑类脂分化不良.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞DNA polβ基因及相关基因表达的影响

目的探讨8-Br-cAMP及槲皮素等分化诱导剂对Eca-109细胞DNA polβ基因及相关基因表达的影响.方法将培养的Eca-109细胞分为3组①加8-Br-cAMP组(Br组);②加槲皮素组(Q组);③不加任何药物对照组(C组).同时培养48 h,将野生型DNA polβ的cDNA, EGFR cDNA,野生型(wt) p53 cDNA及c-myc cDNA分别制备了生物素/地高辛标记的探针进行原位杂交和RNA斑点印迹阵列.另进行POLB,XRCC1,VEGF及PCNA的免疫组化染色及免疫斑点印迹阵列.结果Br组和Q组的DNA polβ,EGFR,c-myc基因表达下调而wtp53基因表达上调.POLB,XRCC1,PCNA及VEGF免疫斑点印迹减弱.8-Br-cAMP及槲皮素显著下调Eca-109细胞的DNA polβ基因表达及相关癌基因表达,同时上调抑癌基因的表达.作为POLB的异二聚体XRCC1及恶性细胞生物标志的PCNA及VEGF表达下调.结论分化诱导剂下调Eca-109细胞DNA polβ基因表达,提示Eca-109细胞的polβ基因是高表达的;功能调整后的polβ通过相关基因表达的改变尤其是wt p53基因表达的上调在癌细胞分化中可能起重要作用.     

平阳霉素（A5）与抗人食管癌非组蛋白抗体交联物对人食管癌Eca－109细胞株的体外抑制效应

我们以非组生白质（ＮＨＰ）抗体作为抗癌药物平阳霉素（Ａ５）的载体，制备ＮＨＰＩｇＧＡ５交联物。应用（１）细胞培养隔日计数示生长曲线；（２）以Ｆｅｕｌｇｅｎ法示细胞ＤＮＡ相对含量；（３）３Ｈ－ＴｄＲ掺入实验、比较了ＮＨＰＩＧ－Ａ５、ＮＨＰＩｇＧ及Ａ５对人食管癌细胞株ＥＣａ１０９的体外抑制效应，四者比较，ＮＨＰＩｇＧ－Ａ５人食管癌Ｅｃａ－ｌ０９细胞株有较强的抑制效应。     

8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响

目的 探讨８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人Ｅｃａ－１０９细胞与生长相关基因表达的影响。方法 体外培育的人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞受８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ处理后,用原位杂交,免疫组织化学及ＲＮＡ,蛋白质斑点印迹技术研究了与细胞生长相关的几种基因的表达变化。结果 ８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ可减弱ＥＧＦＲ,Ｈ－ｒａｓ,ｃ－ｍｙｃ,突变型ｐ５３等原表达,增强野生型ｐ５３基因表达和ｐ２１＾ＷＡＦ１蛋白的表达。     

网滤和免疫实验技术分离人表皮干细胞群体的比较

目的:比较网滤法和免疫实验技术分离人表皮干细胞群体(SCP)的效果,并鉴定SCP的生物学特性.方法:对消化分离的人表皮单细胞悬液进行不同目数(240目、300目、350目)筛网过滤和ELISA及琼脂糖-4B(Sepharose-4B)柱层析的免疫实验技术分离SCP;以形态学、P63-免疫反应性(IR)/K19-IR生物标志和生物学特性进行SCP鉴定.结果:经300目/350目筛网过滤可分离出约50%的P63-IR细胞群体,应用2项免疫实验技术皆可分离出约90%的P63-IR/K19-IR的细胞群体;应用ELISA法分离出表皮细胞的接种数虽然低于仅经240目筛网过滤法,但表皮细胞融合时间却提前了5 d(P均＜0.05);而且融合后分化的表皮切片呈现复层,一些基层细胞呈现P63-IR阳性反应.结论:筛网过滤法分离效率虽较低,但操作简单;免疫实验技术分离效率较高,ELISA技术操作较方便,而Sepharose-4B柱层析技术较复杂.     

板层鱼鳞病患者指甲内皮蛋白与TGase1酶的表达及其TGM1基因序列分析

目的观察板层鱼鳞病（LI）患者指甲转谷氨酰胺酶1（TGase1）与内皮蛋白的表达变化，分析其TGM1基因序列。方法分别自8例u患者（u组）和8例健康人（c组）的指甲中提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳，分别采用免疫印迹及斑点印迹法检测内皮蛋白和TGase1。对LI组不同家系两个家族的2例患者血液进行TGM1基因序列分析。结果LI组指甲总蛋白SDS．PSGE电泳呈5条主带，即38、48、54、63、69kDa，而C组仅呈现前4条主带。LI组内皮蛋白主要定位于63、69kDa主带，C组内皮蛋白仅定位于63kDa主带。两组内皮蛋白及TGasel的灰度值（GSM）相比，P均〈0．05。2例u患者TGM1基因序列第8、12、13外显子皆有错义的点突变。结论LI患者的指甲内皮蛋白过度表达、TGase1低表达，TGM1基因序列异常。     

DIFA检测非放射性斑点印迹技术的探讨

为提高分子生物学的实验效率和节省昂贵的试剂，将核酸分子或蛋白质分子预先结合于硝酸纤维素膜（ＮＣＭ）上，应用自制的ＤＩＦＡ装置检测非放射性斑点印迹。结果表明：此技术可快速检测生物活性试剂的效价及工作浓度；选择研究样本及试验条件；鉴定探针灵敏度。